本文綜述了四種代表性檢測(cè)小分子化合物的非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法：和;概述了小分子化合物非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析的發(fā)展情況;討論了面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)和可能的解決方案;旨在啟發(fā)小分子化合物免疫分析新方法的開發(fā)。

【正文】

開發(fā)非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析

　　免疫分析由于其靈敏、易用和低成本等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于診斷、環(huán)境與食品檢測(cè)。然而小分子化合物無(wú)免疫原性且僅有一個(gè)表位，其免疫分析常采用靈敏性低、工作范圍窄(相對(duì)夾心法免疫分析法)的競(jìng)爭(zhēng)法。改進(jìn)小分子化合物免疫分析的策略包括：設(shè)計(jì)半抗原改善免疫原性以制備高親和力抗體;開發(fā)新的信號(hào)放大材料或檢測(cè)模式如：量子點(diǎn)(QDs)、上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNPs)、金屬有機(jī)框架(MOFs)、聚集誘導(dǎo)發(fā)光熒光微球(AIEgens)以提高靈敏度;以及以彌補(bǔ)競(jìng)爭(zhēng)法的不足等。

基于抗獨(dú)特型抗體的免疫分析、基于抗異型抗體的免疫分析、開放夾心免疫分析

　　本文聚焦于非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析的研究進(jìn)展，介紹了四種具有代表性的非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析：以及(圖1)，概述了這些方法在小分子化合物檢測(cè)領(lǐng)域的前景和挑戰(zhàn)。

　　圖1：小分子化合物非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析發(fā)展的時(shí)間線。

一、基于抗獨(dú)特型抗體的免疫分析

　　根據(jù)Jerne的免疫網(wǎng)絡(luò)理論，抗獨(dú)特型(anti-idiotype)抗體(Ab2)是識(shí)別靶標(biāo)特異性抗體(Ab1)可變區(qū)獨(dú)特位的抗體，具有免疫調(diào)節(jié)作用。Ab2包括Ab2α和Ab2β，Ab2β作為抗原內(nèi)影像，靶向Ab1的抗原識(shí)別位點(diǎn)，可以完全阻斷抗原與Ab1結(jié)合，而Ab2α識(shí)別Ab1可變區(qū)域的其他表位。由于空間位阻，Ab2α和Ab2β不能同時(shí)結(jié)合Ab1。

　　1990年，Barnard和Kohen首次開發(fā)出雌二醇的抗獨(dú)特型免疫分析：當(dāng)靶標(biāo)存在時(shí)Ab1與銪標(biāo)Ab2α結(jié)合，有信號(hào);靶標(biāo)不存在時(shí)Ab1與Ab2β結(jié)合，無(wú)信號(hào)，該方法LOD低至2 fmol(圖2A)。此后，檢測(cè)黃體酮，去氧膽酸7-N-乙酰氨基葡萄糖苷、11-脫氧皮質(zhì)醇的抗獨(dú)特型免疫分析也被陸續(xù)報(bào)道(圖2B)。然而，產(chǎn)生Ab2的雜交瘤很難篩選，陽(yáng)性克隆率通常低于1%(圖2C)。為提高篩選效率，可從噬菌體展示抗體庫(kù)中篩選重組抗獨(dú)特型抗體(rAb2)，如：?jiǎn)捂溈贵w、納米抗體(圖2D)。

　　rAb2和Ab1之間的結(jié)合價(jià)也會(huì)影響分析靈敏度。當(dāng)單價(jià)rAb2以兩倍于傳統(tǒng)mAb2的摩爾速率與mAb1結(jié)合時(shí)，可能會(huì)增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度、提升靈敏度。然而當(dāng)rAb2體積較小時(shí)，空間位阻不足，Ab1可能同時(shí)結(jié)合rAb2α和rAb2β從而產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。未來(lái)的研究應(yīng)關(guān)注平衡Ab2的大小及其空間位阻的關(guān)系，制備相匹配的Ab2和Ab1。

　　圖2:抗獨(dú)特型免疫分析原理與示例

二、

　　相比于涉及三種抗體的抗獨(dú)特型分析，基于抗異型(metatype)抗體的非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析更簡(jiǎn)單。靶標(biāo)和抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物(IC)后形成的新表位稱為異型位點(diǎn)。用免疫復(fù)合物作為抗原時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生僅識(shí)別異型位點(diǎn)的抗異型(抗IC)抗體(圖3A)，進(jìn)而形成抗體-小分子化合物-抗異型抗體的偽夾心。基于該策略，成功制備了靶向δ9-四氫大麻酚、血管緊張素II和微囊藻毒素的抗IC mAb(圖3B)。可以使用各種展示技術(shù)更高效地篩選抗IC重組抗體(rAbs)(圖3C)。

　　制備抗IC抗體的關(guān)鍵問題在于抗體(Ab1)與靶標(biāo)結(jié)合后引起構(gòu)象變化形成新表位，而小分子化合物可能會(huì)被埋進(jìn)mAb1或rAb1的結(jié)合口袋，產(chǎn)生非常隱蔽的構(gòu)象變化。對(duì)此，可以用噬菌體展示的7–11隨機(jī)肽庫(kù)篩選抗IC肽，較小的體積使其能進(jìn)入IC的腔或間隙與IC深處的異型位點(diǎn)相互作用從而建立抗IC免疫分析;該方法已被用于檢測(cè)莠去津、禾草敵。人工合成的抗IC肽有時(shí)會(huì)喪失親和力，或者單價(jià)合成肽結(jié)合相比噬菌體攜帶的肽親和力更差，原因可能是噬菌體維持了肽的構(gòu)象。為解決這一問題，可以將合成肽與一些生物或有機(jī)大分子如：鏈霉親和素、志賀毒素以及十聚水溶性碳水化合物配體聚合物等進(jìn)行偶聯(lián)以產(chǎn)生多價(jià)肽，增強(qiáng)親和力。

　　圖3:抗異型免疫分析原理與示例。

三、開放夾心免疫分析

　　1996年Ueda發(fā)現(xiàn)抗卵溶菌酶抗體的VH和VL之間的相互作用可以被抗原增強(qiáng)導(dǎo)致抗體可變區(qū)穩(wěn)定化，并基于這一現(xiàn)象開發(fā)了開放夾心免疫分析(OS-IA)。OS-IA僅使用一種抗體，避免了篩選多種抗體帶來(lái)的麻煩，已被成功用于玉米赤霉烯酮、苯甲醛、甲狀腺激素等小分子化合物的檢測(cè)。

　　顯然，建立OS-IA的關(guān)鍵在于如何篩選能被待檢靶標(biāo)增強(qiáng)VH和VL互作的抗體。報(bào)道的篩選方法包括：基于分裂FV(spFv)的噬菌體篩選系統(tǒng)(圖4A)、基于Fab的噬菌體篩選系統(tǒng)(pDong1)(圖4B)以及從現(xiàn)有的雜交瘤產(chǎn)生的mAb中進(jìn)行篩選?？梢栽诳蚣軈^(qū)引入點(diǎn)突變?nèi)趸疺H-VL的初始相互作用提高OS-IA的信噪比。

　　根據(jù)是否需要洗滌分離，OS-IA被分為異相檢測(cè)、均相檢測(cè)。異相檢測(cè)常固定VL，再加入靶標(biāo)和VH形成夾心復(fù)合物后檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度(圖4C)。報(bào)道的異相OS-IA包括：基于噬菌體的OS-ELISA、基于免疫場(chǎng)效應(yīng)晶體管的OS-FET以及基于反向PCR的OS-IA。

　　均相檢測(cè)也被稱為開放夾心熒光免疫分析(OS-FIA)：將熒光分子分別偶聯(lián)至VH和VL，靶標(biāo)驅(qū)動(dòng)VH- VL互作后兩個(gè)熒光分子彼此接近，導(dǎo)致供體能量降低和受體能量增加并產(chǎn)生信號(hào)。被報(bào)道的OS-FIA包括：基于熒光素和羅丹明X的OS-FIA、基于突變GFP融合蛋白的OS-FIA以及基于海腎熒光素酶(RLuc)的OS-FIA。酶的寡聚化和蛋白片段互補(bǔ)分析(PCA)也可用于建立OS-IA。如：將β-半乳糖苷酶(β-gal)的兩種無(wú)活性的突變體δα和δω分別偶聯(lián)VH、VL，二者接近后形成活性酶(圖4D);以及基于納米熒光酶(NLuc)兩個(gè)片段的PCA建立OS-IA(圖4E)。

　　圖4: OS-IA抗體篩選方法與檢測(cè)示例。

四、基于淬滅體的免疫分析

　　將抗體與熒光染料(如TAMRA、R6G和ATTO等)偶聯(lián)制備的淬滅體(Q-body)也可用于建立均相非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析。抗原不存在時(shí)，染料由于其疏水性靠近抗原結(jié)合區(qū)的色氨酸(Trp)殘基，發(fā)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)，關(guān)閉熒光;反之，抗原結(jié)合抗體后染料向外移動(dòng)，阻止PET，打開熒光(圖5A)。

　　不難發(fā)現(xiàn)Q-body的作用依賴于抗原與染料的競(jìng)爭(zhēng)，而抗體的抗原結(jié)合區(qū)往往位于N端，所以一般將染料標(biāo)記在抗體N端。報(bào)道的標(biāo)記策略包括：使用無(wú)細(xì)胞翻譯介導(dǎo)的位置特異性標(biāo)記(圖5B)、在輕重鏈的兩個(gè)N端都引入染料構(gòu)建Fab型Q-body、使用琥珀酸(UAG)密碼子或四堿基密碼子(CGGG)在同一Fab引入兩個(gè)不同的熒光染料、結(jié)合重組抗體的原核表達(dá)和巰基馬來(lái)酰亞胺標(biāo)記大量制備Q-body(圖5C)、基于納米抗體制備Q-body等。

　　也可用直接偶聯(lián)法制備Q-body：如利用Rapoport’s salt在Fab N端特異性引入酮羰基偶聯(lián)具有氨基或酰肼基的熒光染料、用吲哚-3-丁酸偶聯(lián)的熒光素與抗體核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)進(jìn)行紫外光化學(xué)交聯(lián)構(gòu)建scFv型Q-body、使用還原性烷基化反應(yīng)選擇性標(biāo)記抗體的N端α-氨基制備基于單抗或多抗的Q-body、基于卷曲螺旋寡聚化結(jié)構(gòu)域快速制備卷曲Q-body、用金黃色葡萄球菌分選酶A(SrtA 7+)的突變體實(shí)現(xiàn)Q-body的多種熒光偶聯(lián)策略等。

　　由于結(jié)構(gòu)、Trp殘基分布各異，不是所有抗體都能制備Q-body，所以Q-body的開發(fā)要進(jìn)行大量篩選實(shí)驗(yàn)，因此提高抗體篩選效率對(duì)Q- body的開發(fā)至關(guān)重要。提高篩選效率的嘗試包括：用蛋白M(PM)制成的抗體結(jié)合淬滅探針將Fab或IgG抗體轉(zhuǎn)化為Q-body(圖5D)、用來(lái)自人支原體的PM Q探針篩選Q-body的原型抗體、基于酵母展示和E4/K4-標(biāo)簽相互作用篩選Q-body的原型抗體、基于結(jié)構(gòu)分析設(shè)計(jì)和靶向修飾現(xiàn)有抗體設(shè)計(jì)Q-body繞過(guò)復(fù)雜的篩選程序。

　　圖5: Q-body免疫分析的原理、熒光染料標(biāo)記方法與抗體篩選策略。

結(jié)論與展望

　　本文綜述了四種用于小分子快速檢測(cè)的非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析方法。上述研究表明非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析在小分子檢測(cè)方面既具有巨大的潛力也面臨著諸多挑戰(zhàn)。非競(jìng)爭(zhēng)法所用的抗體可以通過(guò)動(dòng)物免疫或展示技術(shù)制備，然而展示技術(shù)的局限性在于成本較高、庫(kù)容有限、譜系信息與親和力提升的可能性受損(與動(dòng)物免疫相比)，因此未來(lái)的研究方向可能是結(jié)合動(dòng)物免疫和體外展示技術(shù)的優(yōu)勢(shì)來(lái)改善抗體發(fā)現(xiàn)過(guò)程，同時(shí)為機(jī)器學(xué)習(xí)提供數(shù)據(jù)集。將新型材料如：MOF、分子印跡復(fù)合物、共價(jià)-有機(jī)框架、碳基材料、硅基材料、聚多巴胺衍生材料，用于前處理可以提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性;將其與非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析結(jié)合是小分子快速檢測(cè)的一個(gè)重要發(fā)展方向。將所有反應(yīng)步驟集成到微流控芯片的芯片實(shí)驗(yàn)室(LOC)，有試劑消耗少、檢測(cè)速度快、便攜和能檢測(cè)護(hù)理點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)，也為非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析開辟了新的可能性。

【原文出處】

Liang, Y.-F.; Yang, J.-Y.; Shen, Y.-D.; Xu, Z.-L.; Wang, H. A Breakthrough of Immunoassay Format for Hapten: Recent Insights into Noncompetitive Immunoassays to Detect Small Molecules.Crit. Rev. Food Sci. Nutr.2024, 1–11.

　　指導(dǎo)教師：王戰(zhàn)輝