【引言】

由于競(jìng)爭(zhēng)性

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)遵循抗原-抗體特異性反應(yīng)原理，具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低、工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。ELISA主要分為夾心ELISA和競(jìng)爭(zhēng)性ELISA。夾心ELISA通過(guò)第一抗體捕獲系統(tǒng)中的抗原，然后通過(guò)標(biāo)記抗體形成抗體-待測(cè)分子-抗體的夾心復(fù)合物，并向前產(chǎn)生免疫識(shí)別信號(hào)。而競(jìng)爭(zhēng)性ELISA是通過(guò)目標(biāo)分析物與人工抗原共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，并隨著目標(biāo)分析物濃度的升高而反向產(chǎn)生免疫應(yīng)答信號(hào)。長(zhǎng)期以來(lái)的觀點(diǎn)是，小分子不能同時(shí)與兩種親和物兼容，并且不可能開發(fā)小分子的夾心ELISA方法。

因此，夾心

然而近年來(lái)，多位研究者建立了許多分子量小于1000 Da的夾心ELISA方法，驗(yàn)證了夾心ELISA適用于小分子的檢測(cè)，并且有高檢測(cè)靈敏度。為了開發(fā)靈敏度更高的夾心ELISA，抗原表位之間的距離應(yīng)該有多大?表位之間的距離應(yīng)該有多大才能不影響夾心復(fù)合體的形成效率?作者從檢測(cè)方法的應(yīng)用出發(fā)，將夾心法靈敏度不低于競(jìng)爭(zhēng)法的表位之間的距離定義為，并將沒(méi)有位阻而形成夾心復(fù)合物的表位之間的距離定義為。。

　　硝基呋喃酮是一種禁用抗生素，經(jīng)常在水產(chǎn)養(yǎng)殖中非法使用。它在體內(nèi)代謝迅速，縮氨基脲(SEM)是硝基呋喃酮的小分子(75 Da)代謝物，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，動(dòng)物源性食品中不能含有SEM。SEM可與鄰硝基苯甲醛(NBA)進(jìn)行高回收率衍生化反應(yīng)。針對(duì)這種SEM- NBA衍生物的抗體可用于SEM免疫分析。在這項(xiàng)研究中，作者使用了幾種SEM衍生物來(lái)評(píng)估兩個(gè)表位之間的距離對(duì)夾心免疫測(cè)定靈敏度的影響(圖1)，并以此探索小分子夾心復(fù)合物的形成規(guī)律。

　　圖1夾心原理及衍生化示意圖

　　【內(nèi)容介紹】

第一個(gè)

作者先是使用衍生化試劑，通過(guò)不同長(zhǎng)度的飽和碳鏈連接模型分子，構(gòu)建了SEM - NBA -間隔臂(Cn)-生物素化合物，作為檢測(cè)目標(biāo)物。之后采用夾心ELISA法測(cè)定表位SEM - NBA-間隔臂-生物素之間的優(yōu)勢(shì)距離和最佳距離(間隔臂長(zhǎng)度升序排列)。夾心ELISA采用兩種實(shí)驗(yàn)方案，包被抗體均為抗SEM - NBA抗體，目標(biāo)檢測(cè)物為不同長(zhǎng)度間隔臂的SEM - NBA -間隔臂(Cn)-生物素，二抗為酶標(biāo)抗生物素抗體或親和素，原理如圖1。以空白+ 3 SD(n = 6)為檢出限。

　　小分子夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的失敗不是由其分子量直接引起的，而是由于表位之間的距離太小而引起的位阻。如果兩個(gè)表位之間的距離足夠大，小分子也可以被夾心結(jié)合。研究表明，兩個(gè)表位之間的距離越短，所需的親和反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，檢測(cè)靈敏度越差。通過(guò)增加反應(yīng)濃度或延長(zhǎng)被測(cè)小分子的孵育時(shí)間，可以提高該限度;但靈敏度過(guò)低，培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不利于該方法的實(shí)際應(yīng)用。

　　圖2不同間隔臂夾心ELISA對(duì)sem - nba -間隔臂生物素的吸光度值

藍(lán)線

圖2中的表示在雙抗體夾心模式下，不同間隔臂對(duì)復(fù)合物形成的影響。當(dāng)丙二醇(propanediol)作為間隔臂時(shí)，吸光度超過(guò)了檢出限。此時(shí)，兩個(gè)表位之間的距離為12 Å，是該模式下的優(yōu)勢(shì)距離。當(dāng)1,6-己二醇(1,6-hexanediol)作為間隔臂時(shí)，吸光度值達(dá)到平臺(tái)值，表明兩種抗體之間沒(méi)有位阻。在這種情況下，兩個(gè)表位之間的距離為16 Å，這是該模式下的最優(yōu)距離。圖2中的表示在抗體-親和素夾心模式下，不同間隔臂對(duì)復(fù)合物形成的影響。以1,3-丙二醇(1,3-propanediol)為間隔臂時(shí)，吸光度超過(guò)了檢測(cè)限。此時(shí)，兩個(gè)表位之間的距離為13 Å，這是該模式下的優(yōu)勢(shì)距離。而以1,6-己二醇(1,6-hexanediol)為間隔臂時(shí)，吸光度達(dá)到平臺(tái)值。在這種情況下，兩個(gè)表位之間的距離為17 Å，這是該模式下的最優(yōu)距離。這些發(fā)現(xiàn)表明，雙抗體夾心法親和力和抗體-親和素夾心法親和力對(duì)表位之間的距離有相似的要求。

　　圖3 SEM夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(n = 6)

夾心

圖3為夾心ELISA SEM標(biāo)準(zhǔn)曲線。雙抗體夾心和抗體-親和素夾心的EC50值分別為11.2和7.3 pg/mL(SEM計(jì)算)，最終檢測(cè)溶液的LOD分別為1.5和0.7 pg/ mL(空白+ 3SD)。與使用相同抗體建立的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA相比，。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是預(yù)處理簡(jiǎn)單。傳統(tǒng)的SEM競(jìng)爭(zhēng)性ELISA需要在通風(fēng)柜中進(jìn)行復(fù)雜的提取和濃縮過(guò)程，以獲得低LOD。然而，作者所開發(fā)的夾心ELISA只需要稀釋以消除基質(zhì)干擾，即可實(shí)現(xiàn)組織樣品的LOD分別為30 ng/kg(雙抗體夾心)和14 ng/kg(抗體親和素夾心)。

　　作者以魚和蝦為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)構(gòu)建的夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。采用靈敏度較高的抗體-生物素夾心ELISA法檢測(cè)樣品。樣品經(jīng)HPLC-MS/MS(未檢測(cè)出SEM)鑒定為陰性樣品，在兩個(gè)陰性樣品中分別以30 ng/kg和100 ng/kg的劑量給藥SEM。采用本研究建立的夾心ELISA法對(duì)陰性和給藥樣品進(jìn)行檢測(cè)。五個(gè)陰性樣本的檢測(cè)沒(méi)有產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，表明樣品中的天然生物素不會(huì)影響夾心ELISA的結(jié)果，因?yàn)楦蓴_物質(zhì)在ELISA洗板步驟中被去除。而給藥樣品的平均回收率為75% ~ 89%，平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為13%，表明該方法可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

　　【結(jié)論】

　　作者研究的新方法具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括靈敏度提高(30倍)、簡(jiǎn)單的操作過(guò)程、環(huán)保，在樣品預(yù)處理過(guò)程中不需要提取、干燥或濃縮。所有硝基呋喃代謝物都含有一個(gè)肼基團(tuán);因此，從理論上講，夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的衍生試劑和路線一般適用于其他硝基呋喃代謝物的檢測(cè)。

　　原文出處linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S030881462301453X

　　指導(dǎo)老師：王戰(zhàn)輝