小分子量蛋白該如何做好WB？
發(fā)布時間：2023-09-11 15:28:42來源：
有些蛋白指標一次就能做成功，而有些指標做無數(shù)次都是失敗。蛋白分子量過大或過小都不易做，今天我們就來聊下小分子量蛋白如果成功做出WB！
一、上樣量
通常Western Blot每孔上樣量為30-50μg，80%蛋白在細胞中的含量很低，當?shù)鞍追肿恿窟^小時，上樣量建議選擇50-100μg。畢竟對 于小分子的蛋白來說，在跑電泳時，稍不留心，蛋白就跑沒影了。
二、凝膠電泳
1.選擇合適膠濃度。分子量小的蛋白，建議配置5%的濃縮膠，分離膠濃度參考下表。
| 分子量（kDa) | 分離膠濃度 |
| X≤10 | 15% |
| 10<X≤15 | 13.5% |
| 15<X≤25 | 12% |
2.電泳電壓太大會導致跑在最前面的小分子蛋白成鋸齒狀，建議濃縮膠用80V 30分鐘，之后調(diào)成100V, 溴酚藍跑到距膠底1cm以上就停下，不要跑到底，否則目的蛋白可能跑出去了。
三、轉(zhuǎn)模
.膜的選擇
1。免疫印跡中常用的固相材料有 NC 膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF 膜等。推薦選用 PVDF 膜(聚偏二氟乙烯)，因為蛋白質(zhì)與 PVDF 膜以疏水力結(jié)合，從而將親水部位暴露到液相，使抗體更容易與之結(jié)合。
針對不同分子量的蛋白質(zhì)，PVDF 膜有兩種規(guī)格：0.45 μm 的膜適合檢測 MW > 20 kDa 的蛋白質(zhì)，0.2 μm 的膜適合檢測MW < 20 kDa 的蛋白質(zhì)，而且0.2 μm 的膜可以有效防止蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移過程中直接穿透過膜。PVDF 膜使用之前需要在甲醇中浸泡 5min 后再轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移液中，PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合。
轉(zhuǎn)膜方式
2.。對于小分子蛋白，電流太大或時間太長容易轉(zhuǎn)過。轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)，條件參考下圖
| 分子量（kDa) | 轉(zhuǎn)膜條件 |
| X≤10 | 恒流200mA,30min |
| 10 < X≤15 | 恒流200mA,40min |
| 15< X≤20 | 恒流200mA,50min |
3.轉(zhuǎn)膜前的平衡時間短點，幾分鐘甚至1min就好。平衡所用的液體及轉(zhuǎn)膜液成份相同，都不要加SDS，效果是天壤之別。
四、轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色，測定蛋白豐度。
PVDF膜經(jīng)麗春紅染色后，可以檢測出樣品電泳過程中呈現(xiàn)印跡的大小，通過各個泳道上樣品印跡的對比，可以初步判斷上樣量的準確性。
五、一抗的稀釋比例。
通常抗體的說明書上都會給出一定的稀釋比例對于分子量過小的蛋白來說，一抗應(yīng)選擇低的稀釋比例，這樣有助于抗體的結(jié)合。
六、顯影要把握曝光時間。
根據(jù)信號的強弱適當調(diào)整曝光時間，如果在暗處馬上可以看到條帶，建議曝光時間在30s-2min內(nèi)完成，如果信號較弱，第一遍滴加顯影液后條帶不會很清晰，可以把膜拿出來放一邊讓它反應(yīng)一會，然后再放回機器里面，重新滴加顯影液顯影，效果就會好不少。還有適當延長顯影時間，就能獲得清晰的條帶。
以上就是關(guān)于小分子量蛋白WB實驗的一些經(jīng)驗建議，希望對還被小分子量蛋白WB折磨的朋友們有幫助。
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