【摘要】

偽造的以及不合格的抗生素是日益嚴(yán)重的全球性問題，不合格的抗生素會導(dǎo)致患者死亡率增加，導(dǎo)致嚴(yán)重的全球耐藥性問題。監(jiān)測抗生素的難點在于檢測其活性成分，而大多數(shù)偽造藥物最常見于發(fā)展中國家，由于無法使用復(fù)雜的儀器，使得監(jiān)測偽造的抗生素成為難題。在這篇文章，作者描述了一種微流體紙基分析裝置 (μPAD) 的開發(fā)和優(yōu)化，用于檢測偽造程度最高的一類β-內(nèi)酰胺抗生素中的活性成分。該測定基于酶競爭實驗，是第一個在紙基設(shè)備中報道的競爭性酶測定。該測定使用頭孢硝噻吩（一種顯色底物）與β-內(nèi)酰胺抗生素競爭β-內(nèi)酰胺酶。黃色表示合法藥物，而顏色從黃色變?yōu)榧t色表示偽造藥物。除了測試活性成分外，還增加了設(shè)備的另一部分來測試樣品 pH 值，以進(jìn)一步驗證結(jié)果并識別常見的偽造成分，如阿司匹林或小蘇打。已經(jīng)生成了四種不同抗生素（包括頭孢唑啉）的校準(zhǔn)曲線，使其成為第一個能夠同時檢測頭孢菌素和青霉素抗生素的紙基設(shè)備。μPAD 還使用常見的偽造成分和四種片劑或注射劑形式的抗生素進(jìn)行了測試，證明了其在現(xiàn)場進(jìn)行偽造抗生素測試的潛力。

【背景】

隨著20世紀(jì)初抗生素的出現(xiàn)，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)生了翻天覆地的變化，當(dāng)時的醫(yī)生可以開始有效地使用抗生素治療細(xì)菌感染。然而，抗生素只有在合格的情況下才對患者有幫助。偽劣藥品已成為世界衛(wèi)生組織 (WHO) 和國際警察組織 (INTERPOL) 公認(rèn)的嚴(yán)重的世界性問題。盡管這些團(tuán)體付出了很多努力，但根據(jù)藥物安全研究所的數(shù)據(jù)，2002年至2010年間，報告的藥物造假案件數(shù)量增加了10倍以上。盡管這種增加可能是由于意識提高和監(jiān)測工作，不可能知道有多少假藥未被發(fā)現(xiàn)。由于在線藥店的銷售，假藥銷售在發(fā)達(dá)國家仍然很普遍，但在發(fā)展中國家的銷售額最高，這使得藥品難以追蹤和檢測。WHO估計全世界多達(dá)10%的藥物可能被偽造，其中50%涉及抗菌劑。

偽造和不合格的抗生素通常會導(dǎo)致治療失敗，增加患者死亡的幾率。除了增加死亡率外，治療失敗還導(dǎo)致更多患者接受不必要的廣譜抗生素治療，從而導(dǎo)致日益嚴(yán)重的全球抗生素耐藥性問題。據(jù)估計，全球市場上有50%的抗生素是偽造的。

在這些抗生素中，β-內(nèi)酰胺類是最常見的偽造品，占全球偽造抗生素的一半。測定藥物純度的標(biāo)準(zhǔn)程序是通過質(zhì)譜（MS）和高效液相色譜（HPLC）。然而，由于無法獲得這些昂貴的儀器，發(fā)展中國家很難測試藥物純度。因此，藥物療效通常取決于在資源有限的環(huán)境中包裝和標(biāo)簽的質(zhì)量。盡管合法的制藥公司在標(biāo)簽上加大了力度，以區(qū)別于偽造的銷售商，但偽造的藥品制造商有可能取代合法包裝中的抗生素。為了幫助解決這一問題，全球醫(yī)藥衛(wèi)生基金會制造了GPHF Minilab，使用薄層色譜法進(jìn)行現(xiàn)場藥物成分分析。雖然一個強(qiáng)大的系統(tǒng)可以測試數(shù)十種抗生素和抗瘧藥物的真實性，但它仍然需要初始投資成本和訓(xùn)練有素的人員來操作，不是一個可以供外行使用的系統(tǒng)。因此，仍然非常需要廉價的便攜式設(shè)備，未經(jīng)培訓(xùn)的個人可以使用這些設(shè)備來確定抗生素中活性藥物成分的純度。

基于紙基的微流體分析設(shè)備(microfluidic paper-based analytical device，μPAD)在發(fā)展中國家的即時診斷和檢測方法領(lǐng)域獲得了巨大的關(guān)注。由于紙張具有存儲試劑的天然能力、吸液性能和成本，因此紙張是一種比其他材料更有吸引力的即時檢測平臺。由于這些特性，在過去十年中有數(shù)以千計的出版物展示了在大量復(fù)雜的生物和環(huán)境樣品基質(zhì)中對金屬、生物分子、細(xì)菌和病毒進(jìn)行紙基檢測。

2013年，Weaver等人開發(fā)了一種μPAD，用于篩選β-內(nèi)酰胺類抗生素和抗結(jié)核藥物，以確保純度。雖然這是一個很有前途的系統(tǒng)，也是向廉價的現(xiàn)場藥物分析邁出的重要一步，但該設(shè)備是定性的，主要側(cè)重于檢測常見的替代藥物成分和未經(jīng)批準(zhǔn)的賦形劑。為了測試氨芐西林和阿莫西林的活性成分，作者描述了使用銅元素作為定性比色指示劑。Fernandez等人也對氨芐西林和阿莫西林的檢測進(jìn)行了研究，但對其他β-內(nèi)酰胺類抗生素沒有研究。此外，盡管60%的假藥不含活性成分，但其余40%的假藥含有不同量的活性成分，暴露了定性檢測方法的不足。2014年，Koesdjojo等人報道了一種用于檢測青蒿琥酯抗瘧藥的μPAD，它通過使用固紅的活性成分的反應(yīng)來檢測活性成分。雖然這種方法為青蒿琥酯抗瘧藥提供了極好的結(jié)果，但它不能擴(kuò)展到常見的 β-內(nèi)酰胺抗生素 因此，仍然需要一種能夠定量測試所有 β-內(nèi)酰胺抗生素的通用純度的廉價且便攜的設(shè)備。

頭孢硝噻吩是一種顯色頭孢菌素，于1972年首次被報道為一種新型且直接的底物，用于檢測對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有耐藥性的細(xì)菌。在 β-內(nèi)酰胺酶存在的情況下，頭孢硝噻吩被水解。β-內(nèi)酰胺酶是一種細(xì)菌酶，通過水解β-內(nèi)酰胺環(huán)使抗生素失活，從而促進(jìn)對 β-內(nèi)酰胺抗生素的耐藥性。頭孢硝噻吩被β-內(nèi)酰胺酶水解后，會出現(xiàn)明顯的顏色變化，從黃色變?yōu)榧t色，從而可以檢測β-內(nèi)酰胺酶。利用頭孢硝噻吩，我們小組之前曾報道過一種基于紙質(zhì)的現(xiàn)場測試，該測試使用 PAD 檢測環(huán)境細(xì)菌分離物和污水中的 β-內(nèi)酰胺抗性細(xì)菌。

應(yīng)用頭孢硝噻吩-β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)，作者開發(fā)了一種基于紙基的裝置，可使用酶促競爭測定法檢測 β-內(nèi)酰胺抗生素的存在。通過將抗生素溶解在水中并將其添加到設(shè)備中，該溶液將使干燥的頭孢硝噻吩再水化并移動到含有沉積的β-內(nèi)酰胺酶的檢測區(qū)。如果存在抗生素，它們將以濃度依賴的方式與稀釋的頭孢硝噻吩競爭 β-內(nèi)酰胺酶活性位點，導(dǎo)致在測量過程中幾乎沒有顏色變化。如果抗生素是偽造的，β-內(nèi)酰胺酶將更快地與頭孢硝噻吩反應(yīng)，因為不會競爭活性位點，因此裝置變成紅色（方案 1）。為了進(jìn)一步驗證結(jié)果，μPAD 中的第二個通道用于確定 pH 值，因為一些偽造的試劑會強(qiáng)烈影響溶液的 pH 值。該 μPAD 展示了使用四種不同的 β-內(nèi)酰胺抗生素（包括青霉素和頭孢菌素抗生素）區(qū)分偽造抗生素和合法抗生素的能力。還使用四種不同的片劑和注射劑形式的抗生素以及六種不同的常見賦形劑和在偽造藥物中發(fā)現(xiàn)的活性成分替代品對檢測元件進(jìn)行了測試。據(jù)我們所知，這是酶競爭試驗作為 μPAD 檢測方法可行性的首次證明。

Scheme 1（a）最終優(yōu)化的抗生素純度裝置：帶有 pH 指示劑區(qū)域和抗生素純度區(qū)域。pH 指示劑區(qū)域包含溴酚藍(lán) (1)、酚紅 (2) 和酚酞 (3)?？股丶兌葏^(qū)域包含一個帶有β-內(nèi)酰胺酶 (4) 和頭孢硝噻吩 (5) 的檢測區(qū)。(B) 使用酶競爭作為檢測元件。當(dāng)抗生素合法時，氨芐青霉素將比頭孢硝噻吩唑以更高的濃度存在于檢測區(qū)，因此，設(shè)備將保持黃色。當(dāng)抗生素被偽造時，檢測區(qū)會出現(xiàn)更多的頭孢硝噻吩與β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致顏色由黃變紅。

【結(jié)果和討論】

酶競爭：概念驗證

在設(shè)計μPAD之前，驗證了溶液中的酶競爭測定以確定它是否是 β-內(nèi)酰胺抗生素的可行檢測元件。為證實這一觀點，將濃度范圍為 0.01 至 100 mM 的氨芐青霉素（一種常見的偽造β-內(nèi)酰胺抗生素）與恒定濃度的頭孢硝噻吩混合。頭孢硝噻吩和氨芐青霉素的混合物在96孔板中與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)，反應(yīng)15分鐘后用微孔板讀數(shù)儀在OD510 nm下分析結(jié)果。氨芐青霉素與頭孢硝噻吩的摩爾比范圍為 1:100 至 100:1，隨著氨芐西林濃度的增加，紅色水解的頭孢硝噻吩在 λmax 處的吸光度降低（圖 1），表明酶競爭是一種可行的抗生素檢測方法。

Figure 1 使用分光光度計法作為概念證明，當(dāng)與頭孢硝噻吩相比存在更多氨芐青霉素時，β-內(nèi)酰胺酶會選擇性地與氨芐青霉素反應(yīng)，從而導(dǎo)致頭孢硝噻吩的水解較少，因此顏色變化較小（n＝3）。

基于紙基的微流體器件優(yōu)化

雖然使用微孔板讀數(shù)儀測定吸光度是確定氨芐青霉素相對于頭孢硝噻吩濃度的可靠且可量化的方法，但它需要使用昂貴且不便攜的儀器。有便宜的便攜式分光光度計可供使用。但是，這些儀器的價格可能超過 3000 美元，并且需要多種解決方案才能完成測試。理想的檢測系統(tǒng)可以由幾乎沒有受過訓(xùn)練的人使用，并且不需要任何外部儀器或樣品以外的溶液。使用μPAD格式，可以實現(xiàn)這些需求。利用紙張儲存試劑的能力和天然的液體芯吸特性，構(gòu)思了一種裝置，用戶只需添加樣品并等待15分鐘，看看是否發(fā)生顏色變化（方案1A）。頭孢硝噻吩儲存在該裝置抗生素純度部分的通道中，該通道通向儲存β-內(nèi)酰胺酶的檢測區(qū)。因此，當(dāng)用戶添加樣品時，液體會沿著通道芯吸，將儲存的頭孢硝噻吩再水化并輸送到檢測區(qū)，與 β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生反應(yīng)。如果用戶的樣品中含有抗生素，它的濃度應(yīng)該比頭孢硝噻吩高，因此β-內(nèi)酰胺酶會與抗生素發(fā)生反應(yīng)，設(shè)備會保持黃色。然而，如果用戶的樣品是偽造的并且不含活性抗菌成分，頭孢硝噻吩將成為系統(tǒng)中 β-內(nèi)酰胺酶水解的主要底物，導(dǎo)致明顯的從黃色到紅色的顏色變化（方案 1B）。

對該設(shè)備的幾個方面進(jìn)行了優(yōu)化，包括β-內(nèi)酰胺酶和頭孢硝噻吩濃度（圖2）。為了優(yōu)化裝置上的 β-內(nèi)酰胺酶，將 1-100 U/mL 的濃度在各種條件下干燥到簡單的圓形裝置上（圖 2A）。低于 75 U/mL 的濃度不會產(chǎn)生強(qiáng)烈的顏色變化，而較高的濃度不會增加顏色強(qiáng)度。與在室溫 (~22 °C) 下干燥相比，4 °C 下在紙上干燥酶得到了最好的結(jié)果，這可能是由于酶在較低溫度下在溶液中更穩(wěn)定。通過在通道中干燥不同濃度 (0.5–7.5 mM) 的頭孢硝噻吩，使用設(shè)備的抗生素純度部分優(yōu)化頭孢硝噻吩濃度（圖 2B）。與 β-內(nèi)酰胺酶優(yōu)化不同，顏色強(qiáng)度是針對無抗生素（代表偽造抗生素）和高濃度氨芐青霉素（代表合法抗生素）測量的。計算偽造和合法樣品的顏色強(qiáng)度之間的差異，以確定能夠最有效地區(qū)分兩種樣品的頭孢硝噻吩濃度。正如在圖2B中觀察到的，當(dāng)差距開始再次縮小時，合法抗生素和偽造抗生素之間的對比度增加到3 mM。盡管使用較高濃度頭孢硝噻吩的偽造抗生素的顏色強(qiáng)度很高，但合法抗生素的顏色強(qiáng)度在3 mM 后增加（圖 2B）。這種差異可能是由于兩個不同的原因造成的。正如我們之前報道的那樣，與水解前的稀釋樣品相比，較高濃度的非水解頭孢硝噻吩往往顯得更紅，這可能導(dǎo)致使用高濃度頭孢硝噻吩時檢測區(qū)更紅。其次，因為這是一種酶競爭測定，增加頭孢硝噻吩濃度會導(dǎo)致與樣品中存在的抗生素產(chǎn)生更多競爭，因此與較低濃度的頭孢硝噻吩相比，β-內(nèi)酰胺酶與高濃度頭孢硝噻吩的反應(yīng)更頻繁。

Figure 2 μPAD襯底的優(yōu)化。(A) 檢測酶β-內(nèi)酰胺酶的濃度和干燥方法的優(yōu)化。(B) 基于無抗生素和高濃度抗生素 (n = 3) 之間凈顏色變化的頭孢硝唑濃度優(yōu)化。

除了優(yōu)化試劑濃度和干燥條件外，還有多種紙張可用于μPAD（圖 3A）。由于它們的廣泛使用和廉價的材料，我們將這項研究限制在 Whatman 色譜紙1級和4級。此外，基于紙的設(shè)備可以對環(huán)境開放或用膠帶或?qū)訅簛肀Ｗo(hù)設(shè)備上存在的試劑。由于該裝置包括沉積在紙上的酶，因此由于高溫可能使酶變性而取消了層壓。用 Whatman 1 紙制造并貼在底部和頂部的設(shè)備提供了最好的性能，因此將其用于最終的設(shè)備優(yōu)化（圖 3A）。由于樣品蒸發(fā)減少，以及更慢和更受控的流動，貼在設(shè)備頂部和底部的設(shè)備可能表現(xiàn)更好。與 Whatman 4 相比，Whatman 1 的孔隙更小，但性能也更好，這支持了流速較慢可提高反應(yīng)效率的假設(shè)。緩慢且受控的流動可能使樣品再水合更多的頭孢硝噻吩與檢測區(qū)的β-內(nèi)酰胺酶發(fā)生反應(yīng)，從而在檢測到偽造的抗生素時導(dǎo)致更明顯的顏色變化。

由于頭孢硝噻吩和β-內(nèi)酰胺酶之間的酶促反應(yīng)是pH依賴性的，驗證該裝置可操作的pH范圍很重要。因此，我們向裝置中添加了pH在4.5至10之間的緩沖液（圖3B）。該裝置在pH 6.5和pH 8之間表現(xiàn)最佳，在酸性pH下不工作。盡管該裝置在pH值高于8時性能表現(xiàn)較差，但它并不像在酸性pH條件下那樣完全停止工作。在堿性條件下，頭孢硝噻吩的水解仍然可以用氫氧根離子而不是水分子進(jìn)行。事實上，在堿性條件下水解更有利，因為氫氧化物比水更親核。堿性溶液中水解速率的增加抵消了在高pH下預(yù)期的酶活性的降低。酸性溶液中的情況正好相反，這就是為什么我們觀察到的信號顯著降低的原因。

Figure 3 μPAD 的其他優(yōu)化。(A) 確定要使用的理想紙張以及設(shè)備是否應(yīng)僅在底部或頂部和底部粘貼。(B) 最終優(yōu)化的pH工作范圍 (n = 3)。

頭孢硝噻吩和β-內(nèi)酰胺酶在紙上的穩(wěn)定性

大多數(shù)偽造抗生素是在資源有限的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的，那里的存儲選擇有限。因此，重要的是確定最有效的方法來存儲試劑而不發(fā)生試劑降解。Nery 等人的一項研究。探究了33種不同的穩(wěn)定劑，用于延長儲存在紙上的葡萄糖氧化酶的保質(zhì)期。作者從這篇論文中選擇了五種最成功和最簡便的穩(wěn)定方法來與 β-內(nèi)酰胺酶一起使用，發(fā)現(xiàn)BSA對儲存能力的影響最顯著。正如 Ramachandran 等人先前所推測的那樣，BSA與紙張結(jié)合，從而減少酶以非活性形式吸附的損失。作者還推測，BSA形成了一層保護(hù)涂層，可以保護(hù) β-內(nèi)酰胺酶免受可能影響活性的試劑的影響。除了選擇穩(wěn)定劑外，作何還優(yōu)化了用作存儲基材的紙張。我們發(fā)現(xiàn) Whatman 1 濾紙比 Whatman 4、硝化纖維素和聚（醚砜）延長了 β-內(nèi)酰胺酶的保質(zhì)期。當(dāng) BSA 用于穩(wěn)定 Whatman 1 濾紙上的 β-內(nèi)酰胺酶時，該酶在室溫下三個月內(nèi)活性沒有下降，并且在儲存一年后仍保留>80% 的活性。

事實證明頭孢硝噻吩更難穩(wěn)定。在室溫下，頭孢硝噻吩在2天內(nèi)降解為紅色水解形式，使其無法用于測定。由于降解機(jī)理是水解，作者試圖通過干燥紙張、在有機(jī)溶劑中稀釋頭孢硝噻吩、真空密封設(shè)備并用干燥劑儲存來保持設(shè)備無水。不幸的是，這些努力只將紙上頭孢硝噻吩的有效保質(zhì)期延長至約1周。要將頭孢硝噻吩儲存超過1周，必須將裝置儲存在冰箱中，以通過水解減緩或停止降解。當(dāng)儲存在4°C時，頭孢硝噻吩至少穩(wěn)定4周。

μPAD用于檢測抗生素純度

如前所述，β-內(nèi)酰胺類抗生素是市場上偽造最多的藥物之一。在β-內(nèi)酰胺類抗生素中，氨芐青霉素和阿莫西林是偽造藥品制造商最常偽造的兩個藥物。然而，重要的是要確定這種方法是否可以普遍用于許多β-內(nèi)酰胺藥物。除了阿莫西林和氨芐青霉素外，該裝置還使用青霉素V和頭孢唑林進(jìn)行了測試。頭孢唑林雖然不屬于青霉素類藥物，但仍屬于頭孢菌素類的β-內(nèi)酰胺類抗生素。當(dāng)在 96 孔板中進(jìn)行酶競爭測定并測量吸光度時，觀察到顏色強(qiáng)度與抗生素濃度之間的線性趨勢，表明該系統(tǒng)可以量化。使用 μPAD 為所有測試的抗生素建立校準(zhǔn)曲線（圖4和5）。

Figure 4 常用抗生素的校準(zhǔn)曲線，包括 (A) 氨芐青霉素（m error = 4.75, b error = 2.64）和 (B) 阿莫西林（m error = 4.17, b error = 2.51）（n = 3）。

所有四種抗生素都顯示出在較高抗生素濃度（青霉素類抗生素為2 mg/mL，頭孢唑林為20 mg/mL）時趨于穩(wěn)定的線性區(qū)域的總體趨勢。由于我們正在測量頭孢硝噻吩水解的紅色強(qiáng)度，曲線顯示出負(fù)趨勢?？股睾吭蕉?，頭孢硝噻吩水解的程度越低，導(dǎo)致紅色強(qiáng)度越低。阿莫西林表現(xiàn)出最大的敏感性，斜率為 -50 mL/ mg，而氨芐西林和青霉素V表現(xiàn)出相似的敏感性，分別為-39和−40 mL/ mg（圖4和5A）。盡管頭孢唑林最終抑制了頭孢硝噻吩和β-內(nèi)酰胺酶的反應(yīng)，但與青霉素類抗生素相比，其敏感性降低了一個數(shù)量級，斜率為-4.0 mL/mg（圖5B）。與青霉素類抗生素相比，β-內(nèi)酰胺酶對頭孢菌素類抗生素的敏感性降低。據(jù)我們所知，與青霉素類抗生素相比，β-內(nèi)酰胺酶對頭孢菌素的敏感性較低的直接證據(jù)尚未發(fā)表。然而，已經(jīng)報道了酶對不同底物的敏感性不同。頭孢硝噻吩不僅可以用于比色法檢測不同抗生素的純度，而且還可以用比色法計算米氏動力學(xué)。這將在未來的工作中完成，以證實該假設(shè)，即與青霉素類抗生素相比，選擇的β-內(nèi)酰胺酶對頭孢菌素類抗生素的敏感性較低。此外，頭孢唑林的分子量為454.5 g/mol，而阿莫西林和青霉素的分子量分別為365.4和334.4 g/mol。大小的差異意味著在相同的mg/mL抗生素濃度下，頭孢唑林的摩爾數(shù)更少，因此相對于頭孢硝噻吩的摩爾比更低。當(dāng)與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)時，較大的分子尺寸也可能導(dǎo)致空間位阻，導(dǎo)致動力學(xué)降低。盡管靈敏度降低，μPAD仍可用于檢測偽造的頭孢菌素β-內(nèi)酰胺類抗生素。與青霉素類抗生素相比，使用者只需在水中溶解更多的樣本。

Figure 5 常用抗生素的校準(zhǔn)曲線，包括（A）青霉素V（m error = 3.77, b error = 2.08）和（b）頭孢唑林（m error = 0.41, b error = 1.96）（n=3）

為了確定這些校準(zhǔn)曲線是否可以識別不合格的抗生素，使用了斜率誤差和計算的線性回歸的Y截距。假設(shè)用戶溶解 1 mg/mL 的氨芐青霉素、阿莫西林和青霉素 V，以及 10 mg/mL的頭孢唑林，這些設(shè)備能夠區(qū)分 70% API（或 65% 氨芐青霉素）和 100% API。盡管理想的系統(tǒng)可以自信地區(qū)分 90% API 和 100% API，但這仍然比目前可用的大多數(shù)其他廉價且用戶友好的現(xiàn)場測試提供更好的定量能力。通過使用試劑打印機(jī)消除由于手工制造而可能存在的設(shè)備間差異，減少與線性回歸線相關(guān)的誤差將是未來工作和優(yōu)化的主題。

μPAD還用于測定片劑和注射劑形式的商業(yè)獸用抗生素的純度?？股仄瑒┎缓?00%抗生素，因為始終存在某種形式的藥物輔料。輔料（定義為片劑中存在的任何非活性成分）的添加有多種原因，包括穩(wěn)定或保存活性成分。因此，即使抗生素存在藥用輔料，也必須確認(rèn)該方法的有效性。該裝置用片劑形式的可注射青霉素G、阿莫西林和Clavamox（也稱為阿莫西林克拉維酸鉀）進(jìn)行了測試。為了確認(rèn)該裝置在任何藥物成分的存在下都不會受到抑制，該裝置還用克林霉素進(jìn)行了測試，克林霉素是一種林可酰胺類抗生素，不應(yīng)與β-內(nèi)酰胺酶反應(yīng)，使該裝置變紅。在10 mg/mL的濃度下，該裝置驗證了抗生素是純的（圖6），或者克林霉素是“偽造的”。該方法的一個關(guān)注點是使用β-內(nèi)酰胺酶的酶促反應(yīng)，克拉維酸（一種用于Clavaox或Augmentin的知名β-內(nèi)酶抑制劑）可以抑制β-內(nèi)酰胺酶。片劑可能含有阿莫西林，但不含克拉維酸，這一測試可能無法確定。當(dāng)用戶檢測Clavaox或Augmentin的真實性時，必須注意β-內(nèi)酰胺酶抑制劑會影響檢測的定量。因此，該測試只能用于“是或否”的答案，即片劑是否含有阿莫西林和克拉維酸，或者兩者都不含有，而不是其中之一。是否可以區(qū)分阿莫西林和阿莫西林-克拉維酸混劑，這將是未來研究的主題。

Figure 6  微流體裝置: dH2O 對照和 50 mg/mL氨芐西林、青霉素 V 和頭孢唑啉，以及 10 mg/mL  Amoxi、Clavamox 和克林霉素的反應(yīng)。

測試常用藥物替代品

許多成分被用作偽造藥物中活性成分的替代品，重要的是要驗證該方法仍然適用于各種最常見的替代成分。對于這項研究，作者將偽造成分的范圍限制在偽造藥物中更常見的成分，例如粉筆和糖，以及我們認(rèn)為會干擾檢測的成分。

如前所述，該測定依賴于 pH，因此除了抗生素純度裝置組件外，還向裝置添加了 pH 指示劑部分。當(dāng)檢測處于酸性或堿性 pH 值時，pH 指示區(qū)可以提醒用戶，表明藥物可能被篡改。選擇了三種 pH 指示劑，包括溴酚藍(lán)（方案 1A-1）指示酸性 pH（低于 pH 4.5），酚酞指示堿性pH（方案 1A-3）高于pH 8.5，以及酚紅（方案 1A-2 ) 被添加到系統(tǒng)中，供用戶指示pH值介于6和8之間。

為了確定抗生素是否能與工作pH范圍外的偽造成分區(qū)分開來，對酸性和堿性成分進(jìn)行了測試。選擇乙酰水楊酸（阿司匹林）和碳酸氫鈉（小蘇打）是因為它們的極端pH值以及它們在假藥中的用途。正如預(yù)期，由于其酸性pH值，在裝置中使用阿司匹林導(dǎo)致假陽性（無顏色變化）（圖7）。然而，pH指示器顯示酸性pH值，苯酚紅變黃，溴苯酚藍(lán)變淺棕色。這些現(xiàn)象表明pH值約為4，低于設(shè)備的工作pH值范圍，并正確地將抗生素識別為未經(jīng)頭孢硝噻吩水解的偽造抗生素。另一方面，小蘇打在檢測區(qū)確實顯示出一些顏色變化，表明藥物造假，同時也表明酚酞變?yōu)榉奂t色時的堿性pH值。pH指示劑法唯一的問題在于抗生素也會影響pH值（圖6）。然而，純阿莫西林顯示出偏堿性的pH值，而片劑形式的阿莫西林和克拉瓦克斯顯示出中性/微酸性的pH值。這可能是由于藥物賦形劑，通常可以作為pH穩(wěn)定劑。據(jù)我們所知，片劑形式的抗生素的pH變化尚未發(fā)表；因此，這是一個需要在未來工作中進(jìn)行廣泛優(yōu)化的領(lǐng)域。

Figure 7 為了確定常見的藥物替代品是否會干擾μPAD，使用該設(shè)備測試了六種不同的藥物偽造成分。

除了小蘇打和阿司匹林，其他常見的替代品如粉筆、糖（蔗糖和乳糖）和明膠也進(jìn)行了測試。很可能是因為粉筆和明膠在水中缺乏溶解性，所以使用該設(shè)備進(jìn)行了偽造測試。明膠產(chǎn)生了一種粘性溶液，因此它并沒有完全使裝置飽和（圖7），但它飽和的裝置部分變成了紅色，表明是偽造的。蔗糖和乳糖也被檢測出是假的。

Blind測試

Figure 8 向五名新用戶提供了盲樣本，以使用該設(shè)備進(jìn)行測試，并得出樣本是合法還是偽造的結(jié)論。正確識別了 29/32 個樣本。

對于一般人群使用的此設(shè)備，重要的是要確認(rèn)它可以由未經(jīng)培訓(xùn)且不熟悉 μPAD 的個人使用。六個（或八個）樣品被提供給五個新用戶并標(biāo)記為“假定的”抗生素。為用戶提供了圖 6、7作為完成測試比較的關(guān)鍵，因此用戶可以評估測定結(jié)果。然后，用戶將樣本吸取到設(shè)備中，等待15分鐘，然后判斷樣本中是否含有合法或偽造的抗生素。在沒有偏見的情況下，用戶正確識別了 29/32 的盲樣本（圖8），表明這是一種易于閱讀且用戶友好的測試，可以識別大多數(shù)偽造的抗生素。最難識別的盲樣品是標(biāo)記為頭孢唑林的乙酰水楊酸，這可能是因為兩者具有相似的初始 pH 值，并且乙酰水楊酸由于其酸性 pH 值而不會像其他假冒成分那樣變成紅色。能夠更準(zhǔn)確地區(qū)分這兩種化學(xué)物質(zhì)，將是未來研究和優(yōu)化的課題。

【結(jié)論】

已經(jīng)使用酶競爭測定開發(fā)了一種可以區(qū)分偽造和合法 β-內(nèi)酰胺抗生素的 μPAD。μPAD 測試了五種不同的 β-內(nèi)酰胺抗生素的質(zhì)量，包括頭孢菌素，之前在紙質(zhì)設(shè)備上尚未得到過證實。檢測片劑形式的抗生素證明了其在現(xiàn)實世界分析中的潛力。這項工作也是酶競爭作為 μPAD 可行檢測方法的首次證明。目前的方法是通過目視定性檢測偽造抗生素，這對于現(xiàn)場檢測非常重要，因為超過一半的偽造藥物不含活性成分。然而，據(jù)報道，藥品造假者正在制造含有約 20% 廣告活性成分的抗生素。像這樣的低質(zhì)量抗生素可能會繞過一些現(xiàn)有的檢測系統(tǒng)，因此可以區(qū)分低水平活性成分和無活性成分的便攜式定量系統(tǒng)將成為全球監(jiān)測工作的重要工具。所描述的 μPAD 已顯示定量特性，如四種不同抗生素生成的校準(zhǔn)曲線所示。在未來的工作中，可以優(yōu)化量化設(shè)備顏色強(qiáng)度的便攜式系統(tǒng)，例如手機(jī)應(yīng)用程序。當(dāng)將 μPAD 與便攜式系統(tǒng)結(jié)合使用以量化顏色時，它有可能成為一種廉價且實用的現(xiàn)場設(shè)備，用于檢測偽造和不合格的抗生素。