條帶消失術(shù)：跑完膠發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白人間蒸發(fā)？
背景“星空?qǐng)D”：膜上布滿非特異性斑點(diǎn)，比銀河還耀眼。
陰陽顛倒：實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組更弱？內(nèi)參都跑偏了！
重復(fù)性玄學(xué)：同一批樣本，兩次結(jié)果天差地別……
如果你也經(jīng)歷過以上“慘案”，別慌！這篇保姆級(jí)攻略將帶你從原理到實(shí)操，徹底征服WB實(shí)驗(yàn)！
一、Western Blot實(shí)驗(yàn)基本原理
Western Blot（蛋白免疫印跡）是檢測特定蛋白表達(dá)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”！
基本原理：先利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，使不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中按大小排列。隨后，通過合適的轉(zhuǎn)移方法（如電轉(zhuǎn)移），將分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜（NC 膜）或聚偏氟乙烯膜（PVDF 膜））上。固相載體憑借其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能最大程度維持電泳分離后多肽的原有形態(tài)以及生物學(xué)活性。
接下來，將固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與特異性的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。首先加入一抗，它能夠精準(zhǔn)地識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)蛋白上。之后再加入標(biāo)記有酶或放射性同位素的二抗，二抗與一抗特異性結(jié)合。最后，通過底物顯色或放射自顯影技術(shù)，使反應(yīng)位點(diǎn)產(chǎn)生可見的信號(hào)，從而檢測出電泳分離后的特異性目的蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)蛋白成分的分析。
二、實(shí)驗(yàn)流程圖
1、提取 ：從細(xì)胞或組織中提取蛋白質(zhì)時(shí)，需使用裂解液（如 RIPA 裂解液），并加入蛋白酶抑制劑（如 PMSF）和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白質(zhì)降解和去磷酸化。將裂解后的樣品進(jìn)行離心（一般為 10,000 -14,000g，4℃，10 - 20 分鐘），取上清液即為蛋白提取液。
①常用的RIPA緩沖液(強(qiáng))配方: 1%NP-40或Triton X-100，1% sodiumdeoxycholate，0.1% SDS，150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，pH 7.4，1mMEDTA。
2、定量 ：常用的蛋白定量方法有 BCA 法和 Bradford 法。
BCA 法通過比色法測定蛋白質(zhì)濃度，操作時(shí)需準(zhǔn)確配制試劑工作液，并確保反應(yīng)體系的溫度和時(shí)間一致。
Bradford 法利用考馬斯亮藍(lán) G - 250 染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后的顏色變化來測定濃度，此方法操作簡便，但易受蛋白質(zhì)種類和緩沖液成分的影響。
通常將 BSA（牛血清白蛋白）配制成 2mg/mL 的母液，然后進(jìn)行梯度稀釋，得到 0.5-2.0mg/mL（5 個(gè)點(diǎn)）的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，這是常見的梯度范圍。
一般將樣本稀釋 1:10~1:50，但具體稀釋倍數(shù)需要根據(jù)樣本的大致蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整，確保 OD 值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。
BCA 工作液的配制通常是將試劑 A 和試劑 B 按 50:1 的比例混合，然后加入到標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中，37℃孵育 30min，這個(gè)步驟正確。
在 562nm 波長下讀取 OD 值，這是正確的檢測波長。
如果樣本未稀釋直接檢測，確實(shí)可能導(dǎo)致 OD 值超出儀器的檢測范圍。解決方法是將樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使其 OD 值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，然后重新檢測。
②標(biāo)準(zhǔn)曲線 R²<0.99
移液槍操作誤差是導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線 R² 值過低的常見原因之一?？梢試L試換用反向吸液法來減少誤差，這種方法可以更精確地控制液體的吸入和釋放。此外，確保標(biāo)準(zhǔn)品的配制準(zhǔn)確、孵育條件一致以及比色杯的清潔等也非常重要。
在實(shí)際操作中，還需注意以下幾點(diǎn)：
①移液操作 ：移液槍的使用要規(guī)范，定期校準(zhǔn)移液槍，確保移液的準(zhǔn)確性。
②反應(yīng)條件 ：孵育時(shí)間和溫度要嚴(yán)格控制，過長或過短的孵育時(shí)間以及溫度的波動(dòng)都可能影響檢測結(jié)果。
③比色杯 ：使用比色杯時(shí)，要注意其清潔度，避免因比色杯上的污漬或劃痕影響光吸收的測量。
④試劑新鮮度 ：BCA 試劑要保證新鮮，避免長時(shí)間存放導(dǎo)致試劑失效。
根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇合適的聚丙烯酰胺凝膠濃度。配膠時(shí)，需準(zhǔn)確稱量各種試劑，如丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED 等，并用適量的蒸餾水溶解。注意避免溶液中產(chǎn)生氣泡。
凝膠濃度選擇不當(dāng)可能影響蛋白質(zhì)的分離效果。濃度越高，凝膠孔徑越小，適合分離小分子量蛋白；反之，則適合大分子量蛋白。若配膠過程中試劑混合不均勻或產(chǎn)生氣泡，會(huì)影響凝膠的均勻性和電泳效果。
將蛋白樣品與上樣緩沖液（含 SDS 和巰基乙醇）混合后，加載到凝膠孔中。使用垂直電泳裝置，在適當(dāng)?shù)碾妷合逻M(jìn)行電泳。一般來說，濃縮膠部分使用較低電壓（如 80V），分離膠部分使用較高電壓（如 120 - 150V）。
電泳時(shí)間過長或過短，以及電壓過高或過低，都會(huì)影響蛋白質(zhì)條帶的質(zhì)量和分離效果。時(shí)間過長可能導(dǎo)致條帶跑出凝膠，時(shí)間過短則會(huì)使條帶過于擁擠。電壓過高可能使蛋白質(zhì)變性不充分，電壓過低則會(huì)延長電泳時(shí)間。
濃縮膠 ：80V 恒壓，時(shí)間約為 30min，至溴酚藍(lán)遷移至濃縮膠與分離膠交界處，開始進(jìn)入分離膠。
分離膠 ：120V 恒壓，時(shí)間根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量和電泳情況調(diào)整，一般為 1 - 2 小時(shí)。
制膠氣泡 ：在倒入分離膠時(shí)，應(yīng)將玻璃板輕輕靠在一塊小木板或玻璃片上，呈 45° 傾斜，緩慢注入分離膠，這樣可以使氣泡沿斜面逸出，避免氣泡混入膠中。注入完成后，將玻璃板輕輕放平，使分離膠自然鋪平。若分離膠中存在小氣泡，可用電泳緩沖液或細(xì)針將其挑出。
條帶扭曲 ：每塊膠的電流應(yīng)控制在 15 - 25mA 左右。電泳時(shí)緩沖液需完全覆蓋膠面，否則會(huì)導(dǎo)致電流分布不均，使蛋白質(zhì)遷移速度不一致，造成條帶扭曲。此外，確保電泳槽內(nèi)緩沖液充足且電極連接正確，避免電泳過程中出現(xiàn)局部過熱或電流過大等情況，也有助于防止條帶扭曲。
將經(jīng)過電泳分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體（如 PVDF 膜或尼龍膜）上。轉(zhuǎn)膜前需對(duì)膜進(jìn)行活化，PVDF 膜通常用甲醇浸泡。在轉(zhuǎn)膜裝置中，按順序放置濾紙、凝膠、膜和濾紙，并確保它們之間沒有氣泡。使用濕轉(zhuǎn)裝置，在適當(dāng)?shù)碾娏骱碗妷合逻M(jìn)行轉(zhuǎn)膜（一般為 200 - 250mA，30 - 60 分鐘）。
①濕轉(zhuǎn)法標(biāo)準(zhǔn)操作
膜激活：PVDF膜浸甲醇15秒→轉(zhuǎn)膜液平衡
除氣泡：用玻璃棒滾壓"三明治"結(jié)構(gòu)5次
轉(zhuǎn)膜效率低會(huì)導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)無法轉(zhuǎn)移到膜上，從而在后續(xù)檢測中出現(xiàn)條帶缺失或強(qiáng)度過低的情況。轉(zhuǎn)膜過程中如果電流過大，可能會(huì)使蛋白質(zhì)變性或破壞膜的結(jié)構(gòu)。氣泡的存在會(huì)阻礙蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。
用封閉液（如 5% 的脫脂奶粉或 BSA 溶液）封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，以防止抗體的非特異性吸附。封閉通常在室溫下進(jìn)行，時(shí)間為 1 - 2 小時(shí)。
封閉不充分可能導(dǎo)致抗體的非特異性結(jié)合，增加背景信號(hào)。過度封閉可能會(huì)阻礙抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致信號(hào)過低或無信號(hào)。
一抗孵育 ：將封閉后的膜與特異性一抗在適當(dāng)條件下孵育（如 4℃孵育過夜）。一抗?jié)舛纫话爿^低，需根據(jù)抗體說明書進(jìn)行稀釋。
洗滌 ：用 TBST 緩沖液洗去未結(jié)合的一抗，減少背景信號(hào)。洗滌步驟通常包括 3 - 5 次，每次 5 - 10 分鐘。
二抗孵育 ：加入與一抗相應(yīng)的二抗（通常標(biāo)記有酶或熒光物質(zhì)），在室溫下孵育 1 - 2 小時(shí)。二抗?jié)舛认鄬?duì)較高，也需根據(jù)說明書稀釋。
背景高：二抗?jié)舛冗^高→按1:5000重新稀釋
信號(hào)弱：一抗反復(fù)凍融→分裝保存，現(xiàn)用現(xiàn)配
常用的檢測方法包括化學(xué)發(fā)光檢測和熒光檢測?；瘜W(xué)發(fā)光檢測使用 ECL 試劑，二抗標(biāo)記的酶催化底物發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與目標(biāo)蛋白的量成正比。通過 X 光膠片或成像儀記錄發(fā)光信號(hào)。熒光檢測則使用熒光成像儀直接檢測二抗標(biāo)記的熒光信號(hào)。
化學(xué)發(fā)光檢測中，底物變質(zhì)或酶失活會(huì)導(dǎo)致發(fā)光信號(hào)減弱或無信號(hào)。熒光檢測中，熒光信號(hào)可能受到背景熒光的干擾，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，曝光時(shí)間不當(dāng)也會(huì)影響顯影效果，時(shí)間過短信號(hào)弱，時(shí)間過長可能出現(xiàn)過曝現(xiàn)象。
1. 蛋白定量篇：為什么測不準(zhǔn)？
案例：BCA法測出負(fù)值？
→ 罪魁禍?zhǔn)祝簶颖竞邼舛菶DTA
→ 原因：電泳產(chǎn)熱不均→膠體中部溫度過高
→ 轉(zhuǎn)膜時(shí)間延長至150min
→ 空白對(duì)照：不加一抗（排除二抗非特異結(jié)合）
→ 敲除樣本：使用KO細(xì)胞驗(yàn)證抗體特異性
→ 多抗體比對(duì)：不同貨號(hào)抗體交叉驗(yàn)證
問題匯總：
