先“科普”一下啥是“草泥馬”，可能年紀(jì)大點(diǎn)的老同志還不太知道，是這幾年興起的網(wǎng)絡(luò)詞匯，不過(guò)小盆友們應(yīng)該耳熟能詳了，沒(méi)錯(cuò)，是一群可愛(ài)的羊駝……

      雖然它沒(méi)有駝峰，可它還是駱駝科的動(dòng)物哦。那么啥是納米抗體呢？這個(gè)說(shuō)來(lái)話長(zhǎng)，在駱駝和羊駝體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一種獨(dú)特的抗體：缺失輕鏈的重鏈抗體（HcAb）?？寺∵@種抗體重鏈可變區(qū)可以得到只有重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱為VHH(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)，也稱為納米抗體（nanobody, a single domain antibody）。納米抗體具有高親和力和高特異性的特點(diǎn)，而免疫原性（盡管非人源，但免疫原性很低）和毒性則非常低，且不像scFv那樣容易粘連。

納米抗體最早是由比利時(shí)科學(xué)家 Hamers 等1993 年在自然雜志中首次報(bào)道，在羊駝外周血液中存在一種天然缺失輕鏈的抗體，該抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(VHH)和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，但卻不像人工改造的單鏈抗體片段(scFv)那樣容易相互沾粘，甚至聚集成塊。更重要的是單獨(dú)克隆并表達(dá)出來(lái)的VHH結(jié)構(gòu)具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及與抗原的結(jié)合活性，是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位。VHH晶體為2.5nm,長(zhǎng)4nm,分子量只有15KD,因此也被稱作納米抗體(Nanobody,Nb)。它是最小的功能性抗原結(jié)合片段。和普通抗體相比，納米抗體分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行基因改造，體積小，抗原特異性好，組織穿透力強(qiáng)，穩(wěn)定性高，在疾病的診斷及治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。

納米抗體與普通抗體的結(jié)構(gòu)及功能比較

感染或者免疫過(guò)的駱駝科動(dòng)物的免疫反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生普通的及僅有重鏈的抗體，這兩種類型的抗體均有與抗原結(jié)合的能力。普通的免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)是分子量為150 k Da的四聚體多肽，由兩對(duì)相同的重鏈（50 k Da）和輕鏈（25k Da）多肽組成，二者由鏈間的二硫鍵鏈接。輕鏈由N端的可變區(qū)（VL）和C端的一個(gè)保守的區(qū)域(CL)構(gòu)成。重鏈由四個(gè)或五個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:N端的可變區(qū)（VH），緊接著三至四個(gè)恒定的區(qū)域（CH1,CH2,CH3,可能CH4）。免疫球蛋白形成Y型或T型結(jié)構(gòu)，兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)域通過(guò)CH1及CH2間的柔性鉸鏈區(qū)連接在一起，連到負(fù)責(zé)起效應(yīng)的具有保守結(jié)構(gòu)的FC區(qū)域。在哺乳動(dòng)物中這種免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)相對(duì)比較保守?？贵w的FC區(qū)域由重鏈的CH2及CH3構(gòu)成，介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)（ADCC）及補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)(CDC)。抗體的N端，配對(duì)的VH及VL形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)（FV）,在輕、重鏈每個(gè)可變區(qū)中存在三個(gè)氨基酸長(zhǎng)度及序列高度變異的區(qū)域，簡(jiǎn)稱為CDR1,CDR2,CDR3, 這三個(gè)區(qū)域被四個(gè)序列相對(duì)保守的骨架區(qū)分隔開(kāi)（FR1,FR2,FR3,FR4）。輕重鏈高變區(qū)通過(guò)非共價(jià)結(jié)合聚集成簇，形成大的界面與抗原結(jié)合，也即為抗體決定簇。這些超變的區(qū)域折疊成一些經(jīng)典的loop結(jié)構(gòu)。重鏈可變區(qū)的CDR3在長(zhǎng)度及氨基酸組成上最多變，因此結(jié)構(gòu)也最難預(yù)測(cè)。重鏈抗體缺少普通抗體所有的CH1區(qū)域，且CDR1和CDR3要比VH長(zhǎng)，這在一定程度上彌補(bǔ)了缺失輕鏈造成的抗原結(jié)合力下降的不足。Nanobody的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單僅僅是駱駝重鏈可變區(qū)，如下圖C：

（Nanobody結(jié)構(gòu)模式圖）

A圖：傳統(tǒng)四鏈結(jié)構(gòu)的抗體；

B圖：駱駝血液中的重鏈抗體；

C圖：穩(wěn)定的可結(jié)合抗原的最小單位VHH也稱Nanobody

在序列上，脊椎動(dòng)物中，普通抗體和納米抗體序列大部分相同，但存在五個(gè)保守位點(diǎn)氨基酸差異。Leu12Ser（即12位在VH中常為L(zhǎng)eu, 而在VHH中此位常為Ser）, Val42Phe/Tyr, Gly49Glu, Leu50Arg/Cys, 和Trp52Gly（不是非常保守）。VH中42,49,50,52這四個(gè)位點(diǎn)主要參與與VL 作用，多為疏水的氨基酸，但在VHH中變成了親水的氨基酸，這種序列的改變?cè)黾恿思{米抗體的水溶性，減少了抗體的聚合性，也直接導(dǎo)致了VHH不能夠結(jié)合輕鏈。

在結(jié)構(gòu)上，CDR1由于突變熱點(diǎn)的存在（28位和30位），導(dǎo)致VHH向N端延長(zhǎng)。VHH的CDR3 也較VH的長(zhǎng)，大約為18個(gè)氨基酸，而人的VH常為14，鼠11個(gè)氨基酸。納米抗體僅有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，不含傳統(tǒng)的連接肽序列。除了域內(nèi)保守的二硫鍵，VHH CDR3中的CYS還可以與CDR1或FR2中的CYS形成二硫鍵，這些增加的序列和loop結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了抗體與抗原結(jié)合的面積以及抗體的多樣性，同時(shí)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，能夠耐受高溫及苛刻的極端環(huán)境。其次，納米抗體沒(méi)有傳統(tǒng)的Fc段，從而避免了Fc段引起的補(bǔ)體反應(yīng)。納米抗體易于進(jìn)行基因操作，從而形成單價(jià)、雙價(jià)、雙特異及多價(jià)抗體，同時(shí)也能形成融合蛋白進(jìn)行靶向治療。如下圖所示。

（不同類型的納米抗體）

納米抗體對(duì)人體免疫原性較弱，相容性好。 比較VH germline 序列及單峰駱駝germline 序列，前者大約50種，后者大約40種。駱駝的VHH胚系基因序列和人類VH3家族序列高度同源，因此對(duì)VHH進(jìn)行人源化比較簡(jiǎn)單。

納米抗體分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，并由單一的基因編碼，因此在噬菌體、細(xì)菌及酵母中能大量表達(dá)。納米抗體具有強(qiáng)而快的穿透能力，利于它們進(jìn)入實(shí)體瘤中發(fā)揮作用，同時(shí)由于其能穿透血腦屏障，為腦部給藥提供了新方法。

納米抗體庫(kù)的構(gòu)建

鑒于VHH 與VH的差異主要在于CH1區(qū)域的缺失，因此，建免疫和天然庫(kù)的工作重點(diǎn)在于從IgG中分離出缺少CH1的抗體。可以通過(guò)一步或者二步PCR擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)。PCR的關(guān)鍵在于利用抗體骨架區(qū)的保守核苷酸序列來(lái)設(shè)計(jì)PCR引物。對(duì)于一步法PCR,可以擴(kuò)增從FR1到鉸鏈區(qū)序列，同時(shí)在引物上引入酶切位點(diǎn)。對(duì)于兩步法PCR，第一步PCR:  Leader sequence to CH2的保守區(qū)。會(huì)產(chǎn)生兩種產(chǎn)物，VH（大約 850-900bp）及 VHH （大約550-600bp）。從PCR產(chǎn)物中分離出VHH。第二步 PCR: 以第一步PCR產(chǎn)物為模板，應(yīng)用可變區(qū)的FR1到FR4的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出V
HH序列，同時(shí)也引入酶切位點(diǎn)方便下一步實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增出的抗體序列連接到載體上，其余的步驟同普通的構(gòu)建抗體庫(kù)的過(guò)程。具體流程見(jiàn)下圖。一般納米抗體庫(kù)容量可以比較容易達(dá)到10e8或10e9，多樣性大于95%。同時(shí)由于VHH只有一個(gè)可變區(qū)，庫(kù)容在10e6時(shí)也能篩選到特異性抗體。但是在普通的抗體Fab 或者ScFv庫(kù)中，需要庫(kù)容足夠大才能更容易地篩選得到抗體。

（納米抗體庫(kù)的構(gòu)建及納米抗體的淘選）

VHH可溶性極高，不易聚集，能耐高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等致變性條件，適合于原核表達(dá)和各種真核表達(dá)系統(tǒng)，廣泛用于開(kāi)發(fā)治療性抗體藥物、診斷試劑、親和純化基質(zhì)和科學(xué)研究等領(lǐng)域。

納米抗體的淘選

納米抗體的淘選和普通抗體的淘選比較類似，可以通過(guò)噬菌體展示的方法，淘選到抗原特異性抗體。將普通抗原固定在固相支持的載體上，經(jīng)過(guò)封閉，結(jié)合，洗脫，擴(kuò)增等階段富集抗原特異性抗體。一般通過(guò)2-3輪淘選即可篩選到特異性抗體。同時(shí)也可以在液相中淘選，利用SA包被的磁珠與生物素標(biāo)記的抗原間的特異性結(jié)合，也經(jīng)過(guò)封閉，結(jié)合，洗脫，擴(kuò)增等步驟得到抗原特異性抗體。除了普通的蛋白淘選，也可以用表達(dá)特異性抗原的細(xì)胞進(jìn)行淘選，大體步驟也同蛋白淘選。為了提高淘選得到蛋白的親和力，在每輪淘選時(shí)可以連續(xù)降低抗原的濃度或者細(xì)胞的量，同時(shí)逐步增加洗滌的次數(shù)。在封閉時(shí)加入一些陰性對(duì)照蛋白或者細(xì)胞能提高淘選到的抗體的特異性。淘選得到的抗體依載體的不同，可以表達(dá)在上清或者細(xì)胞周質(zhì)里，通過(guò)ELISA或者FACS驗(yàn)證抗體與抗原的結(jié)合能力。為了下游動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，需要篩選到人、鼠、猴三陽(yáng)的抗體。

納米抗體的優(yōu)勢(shì)

納米抗體諸多方面均優(yōu)于傳統(tǒng)抗體 。基于羊駝重鏈抗體的VHH單域抗體的特殊結(jié)構(gòu)，兼具了傳統(tǒng)抗體與小分子藥物的優(yōu)勢(shì)，幾乎完美克服了傳統(tǒng)抗體的開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)，穩(wěn)定性較低，保存條件苛刻等缺陷，逐漸成為新一代治療性生物醫(yī)藥與臨床診斷試劑中的新興力量。相比于常規(guī)抗體，納米抗體的優(yōu)勢(shì)有:

1.分子量小，可穿透血腦屏障；

2.原核或真核系統(tǒng)中高表達(dá)；

3.特異性強(qiáng)，親和力高；

4.對(duì)人的免疫原性弱；

5.穩(wěn)定性好；

6.可溶性高，吸收好；

7.人源化簡(jiǎn)單；

8.偶聯(lián)其他分子容易。

納米抗體的應(yīng)用

納米抗體能用于：

生物醫(yī)藥研發(fā)(基因工程藥物研發(fā)、ADC藥物研發(fā))；

臨床體外診斷(膠體金法、酶聯(lián)免疫吸附法、電化學(xué)發(fā)光法)；

腫瘤研究、免疫學(xué)研究等基礎(chǔ)研究；

申請(qǐng)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的發(fā)明專利及科研獎(jiǎng)項(xiàng)；

拓展研究思路、發(fā)表國(guó)際知名學(xué)術(shù)刊物。

舉例：

1.納米抗體能用于構(gòu)建多重不同類型的分子結(jié)構(gòu)，在醫(yī)學(xué)診斷和治療上實(shí)用性較高。例如可以構(gòu)建成雙功能抗體或雙特異性抗體進(jìn)行疾病的靶向治療。雙特異性抗體可以識(shí)別一個(gè)靶抗原的相鄰兩個(gè)位點(diǎn)，獲得對(duì)抗原的高親和性，也可以識(shí)別不同的抗原，如腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面的抗原，達(dá)到治愈疾病的目的。與普通的雙特異性抗體相比，它們分子量小，水溶性及穩(wěn)定性高，表達(dá)量也普遍較高。

2.通過(guò)基因改造，納米抗體可以形成多聚體，大大提高了抗體與抗原的結(jié)合能力。通過(guò)基因工程形成納米抗體融合蛋白可以帶上酶或者毒素，融合蛋白在組織穿透，清除速度及穩(wěn)定性上比普通抗體更有優(yōu)勢(shì)，可以用于低濃度抗原的檢測(cè)。

3.由于納米抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，也可應(yīng)用于蛋白晶體結(jié)構(gòu)研究中。納米抗體形成的蛋白復(fù)合物能穩(wěn)定抗原，保持其晶體結(jié)構(gòu)，是研究不穩(wěn)定的蛋白良好載體。

4.納米抗體也能作為胞內(nèi)抗體發(fā)揮作用。大部分抗體在細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有功能，因?yàn)樵诩?xì)胞質(zhì)還原環(huán)境中不能形成二硫化合物，或者靶向亞細(xì)胞部位比較困難，但納米抗體通常比較穩(wěn)定，甚至在胞質(zhì)中能維持其抗原結(jié)合能力。

納米抗體發(fā)展到現(xiàn)在，已經(jīng)擁有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，由于分子量小，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，容易進(jìn)行基因改造，生產(chǎn)成本低，易于進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，因此，納米抗體在疾病治療和診斷及腫瘤的靶向診斷和治療中具有很大的發(fā)展機(jī)遇。現(xiàn)在專門(mén)有個(gè)公司叫Ablynx (http://www.ablynx.com/)專門(mén)從事這種單納米抗體相關(guān)產(chǎn)品的研究與開(kāi)發(fā)。目前已經(jīng)有兩種抗體類藥物處于二期臨床。