非瘟抗體ELISA檢測知識點梳理
發(fā)布時間：2021-07-07 15:40:49來源：原博士帶你做檢測
備受期待的非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒名單終于公布了，我為大家準(zhǔn)備了一些非瘟抗體ELISA知識點，能讓大家在被口吐蓮花的銷售代表忽悠時保持一顆平常心。
33個非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒中有3種類型的ELISA，分別是間接ELISA(17個)，阻斷ELISA(12個)和夾心ELISA(4個)。依據(jù)的是國標(biāo)《非洲豬瘟診斷技術(shù)》(GB/T18648-2020)中的三種ELISA抗體檢測方法。
1.間接ELISA
IgG抗體，
間接ELISA通常用于測定血清中理論上也可以檢測IgM抗體，但是IgM抗體通常使用捕獲ELISA來檢測。間接ELISA是應(yīng)用最廣泛的ELISA方法，由于只要獲得抗原，配合通用的酶標(biāo)抗豬IgG的二抗就可以快速建立ELISA方法。產(chǎn)品性能取決于抗原的純度，抗原純度不夠會導(dǎo)致非特異IgG的結(jié)合，產(chǎn)生假陽性。
實驗流程通常為：
1)準(zhǔn)備好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
加樣：
2)加待檢測的樣品。溫育反應(yīng)一定時間，如果血清中含有針對包被抗原的抗體，則待檢抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)。
加酶標(biāo)二抗：
3)加入酶標(biāo)抗抗體(二抗)，該酶標(biāo)二抗與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合形成抗原—待測抗體—酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，溫育，洗滌。
顯色：
4)加入底物溶液，溫育一定時間后，固相上酶的催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，
終止：
5)加入終止液終止顯色反應(yīng)。
讀數(shù)：
6)使用酶標(biāo)儀測定各孔光密度值(OD值)。
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2.阻斷ELISA/競爭ELISA
IgG抗體
阻斷ELISA/競爭ELISA通常用于測定血清中。阻斷ELISA/競爭ELISA需要抗原和特異性的單抗或多抗。對抗原的純度要求不高，產(chǎn)品的性能取決于單抗或多抗的特異性和親和力。背景干擾低，特異性高。
實驗流程通常為：
1)準(zhǔn)備好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
加樣：
2)加待檢測的樣品。溫育反應(yīng)一定時間，如果血清中含有針對包被抗原的抗體，則待檢抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)。
加競爭抗體：
3)加入酶標(biāo)單抗或多抗，該酶標(biāo)單抗或多抗與待測樣品競爭性與包被抗原結(jié)合，形成抗原—酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，溫育，洗滌。
顯色：
4)加入底物溶液，溫育一定時間后，固相上酶的催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，
終止：
5)加入終止液終止顯色反應(yīng)。
讀數(shù)：
6)使用酶標(biāo)儀測定各孔光密度值(OD值)
3.雙抗原夾心ELISA
IgM、IgG、IgA等
雙抗原夾心ELISA用于測定血清中。技術(shù)難度最高，需要制備高質(zhì)量的酶標(biāo)抗原。該方法不受非特異性IgG的干擾，背景干擾小，敏感性和特異性高。
實驗流程通常為：
1)準(zhǔn)備好包被了已知定量的抗原的ELISA板。
加樣：
2)加待檢測的樣品。溫育反應(yīng)一定時間，如果血清中含有針對包被抗原的抗體，則待檢抗體與固相抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物質(zhì)。
加酶標(biāo)抗原：
3)加入酶標(biāo)抗原，該酶標(biāo)抗原與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合形成抗原—待測抗體—酶標(biāo)抗原的復(fù)合物，溫育，洗滌。
顯色：
4)加入底物溶液，溫育一定時間后，固相上酶的催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，待測樣品中
終止：
5)加入終止液終止顯色反應(yīng)。
讀數(shù)：
6)使用酶標(biāo)儀測定各孔光密度值(OD值)。
根據(jù)文獻中報道具有診斷學(xué)意義的蛋白主要有P72(VP73)蛋白、P54蛋白、P30(P32)蛋白、PP62(P60)蛋白。
1.P72（VP73）蛋白
結(jié)構(gòu)蛋白，由B646L基因編碼，分子量約為73.09kDa。VP73在大多數(shù)毒株中相當(dāng)穩(wěn)定，能與所有感染豬的血清發(fā)生免疫學(xué)反應(yīng)，且其抗原性非常穩(wěn)定。該蛋白是血清學(xué)診斷方法的理想抗原，常被用于抗體檢測。
2.P54蛋白
結(jié)構(gòu)蛋白，由E183L基因編碼，大小約25kDa。在病毒感染的早期階段發(fā)揮作用，是病毒的復(fù)制必需蛋白。P54蛋白具有較好的免疫原性，其產(chǎn)生的抗體能夠阻斷病毒顆粒粘附到易感細(xì)胞上，該蛋白較為保守，產(chǎn)生的抗體在體內(nèi)出現(xiàn)時間早，持續(xù)時間長。
3.P30（P32）蛋白
主要結(jié)構(gòu)蛋白，由CP204L基因編碼，在病毒感染的早期表達，可用于ASF感染早期診斷。
4.PP62（P60）蛋白
由CP530R基因編碼，在病毒復(fù)制晚期表達，經(jīng)過加工生成P35蛋白和P15蛋白。
用于 ASFV 抗體檢測的抗原及其作用
可能會有很多人開始糾結(jié)于到底選擇包被哪種蛋白的試劑盒，個人覺得對于ELISA試劑盒來說，蛋白選擇固然重要，但是試劑盒的生產(chǎn)工藝對試劑性能的影響更大。
三、非洲豬瘟病毒抗體消長
根據(jù)ReisAL試驗數(shù)據(jù)，E183L/ p54, K205R, A104R/histone-like 和 B602L抗體反應(yīng)強，14天IgG抗體100%轉(zhuǎn)陽，持續(xù)39天以上。B646L/p73, CP204L/p32, CP312R, NP419L/DNA ligase 和F334L抗體反應(yīng)中等，14天IgG抗體未100%轉(zhuǎn)陽，但可以檢測到。K196R, K78R/p10 和 C44L抗體較弱。。
ASFV12種蛋白的IgG抗體
E183L/ p54, K205R, A104R/histone-like和B602L四種蛋白的IgM抗體7天可以檢測到，14天開始下降。
ASFV4種蛋白的IgM抗體
四、抗體檢測的確診方法
（以某個品牌的所謂進口試劑盒去評價其他ELISA試劑盒的方法是錯誤的）
ELISA雖然簡單易得，但是ELISA應(yīng)用于篩查檢測時仍然會出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果。那么用什么方法去作為ELISA方法的確診方法呢?
根據(jù)OIE陸生動物手冊，可以使用間接免疫熒光(indirect fluorescent antibody，IFA)、間接免疫酶(indirect immunoperoxidase test ，IPT))和免疫印跡(immunoblotting ，IB)的方法作為ELISA實驗的確診方法。
(The most commonly used is the ELISA , which is suitable for examining serum or plasma. Confirmatory testing of ELISA-positive samples should be carried out using an alternative test, such as the IFAT, IPT or immunoblotting)
五、ELISA試劑盒的選擇
市場上一下出現(xiàn)33個合法ELISA試劑盒究竟那個好呢，公告里也沒告訴大家詳細(xì)的比對數(shù)據(jù)，只能自己去選擇了。
1.看研發(fā)實力
2.看試驗數(shù)據(jù)
3.看臨床應(yīng)用
4.開展試劑盒評價
實驗室應(yīng)具備一定的試劑評價能力，評價方法見：診斷試劑評價系列3-血清檢測方法。
六、不同使用場景下ELISA試劑盒的使用
1.魚和熊掌不可兼得
世界上不存在敏感性和特異性都是100%的診斷試劑。ELISA試劑盒的敏感性和特異性就像一個蹺蹺板，每個廠家都會根據(jù)自己產(chǎn)品的定位找一個平衡點?；蛘咭舾行愿咭恍奚禺愋裕蛘咭禺愋愿咭恍奚舾行?，或者取敏感性和特異性都不是最高，但是很均衡。
2.使用場景的選擇
3.組合應(yīng)用
對于發(fā)病場的篩查，需要先使用高敏感性的試劑進行初篩，陽性樣品再用高特異性的試劑進行復(fù)核。
核酸檢測和抗體檢測也需要定期組合檢測，保證豬群的雙陰性。
一年來豬價起伏，養(yǎng)豬人實屬不易。希望診斷試劑廠家能夠真正為產(chǎn)業(yè)創(chuàng)造價值，為非瘟防控提供有效的工具。
參考文獻：
[1]王功民，田克恭.非洲豬瘟[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.2010年.
[2]田克恭，李明.動物疫病診斷技術(shù)：理論與應(yīng)用[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.2014年.
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[5]ReisAL, Parkhouse RME, Penedos AR, Martins C, Leitão A. Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infected experimentally with African swine fever virus. J Gen Virol. 2007 Sep;88(Pt 9):2426-2434.