一、實驗簡介：

　　Western blot是一種分子生物學(xué)實驗技術(shù)，通過 SDS-PAGE 凝膠電泳將蛋白按照分子量大小分離，然后利用特異性抗體標(biāo)記這些蛋白。在免疫檢測中，通常使用硝酸纖維素或 PVDF(聚偏二氟乙烯)膜作為傳遞介質(zhì)。將凝膠緊貼膜后，通過電流作用使蛋白從凝膠遷移到膜上。接著使用特異性抗體進(jìn)行進(jìn)一步處理，通過次級抗體和檢測試劑使膜顯色，從而檢測目標(biāo)蛋白。Western blot技術(shù)在生命科學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，能夠檢測蛋白的表達(dá)和定量，幫助科研人員更好地研究蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。

二、實驗步驟

1、處理樣品前準(zhǔn)備：

　　(1)將培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶放在冰上，用冰冷的 PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞。

　　(2)吸干 PBS，然后添加適量的冰冷細(xì)胞裂解緩沖液(每 107 細(xì)胞/100 mm 培養(yǎng)皿/150 cm2 培養(yǎng)瓶加入 1 ml;每 5×106 細(xì)胞/60 mm 培養(yǎng)皿/75 cm2 培養(yǎng)瓶加入 0.5 ml)。

　　(3)用預(yù)冷的塑料細(xì)胞刮板刮下貼壁細(xì)胞，將懸浮細(xì)胞液輕柔地轉(zhuǎn)移至預(yù)冷微量離心管中。

　　(4)在 4 ℃ 下持續(xù)攪拌 30 分鐘。隨后進(jìn)行超聲處理。以探頭超聲儀為例，設(shè)定功率為 40W 或總功率的 40%，進(jìn)行多次打 3 秒停 3 秒的超聲處理，每次超聲 5-10 次。超聲后，裂解液將變得清澈且不再黏稠。加入Loading緩沖液后進(jìn)行煮樣。注意：跨膜蛋白不宜煮樣，直接加入Loading緩沖液;(若使用水浴超聲，則適當(dāng)延長時間，超聲 30 秒至 2 分鐘，全程保持在冰浴環(huán)境中)。

　　(5)若無超聲儀，可使用帶注射器的針頭(20G-18G-16G)在冰上多次抽吸，直至裂解液變清澈。

2、解剖樣品前準(zhǔn)備：

　　(1)使用干凈的器械在冰上解剖目標(biāo)組織。為防止蛋白酶的降解，最好在盡快完成解剖過程。

　　(2)將解剖好的組織放入圓底離心管或 Eppendorf 管中，立即浸入液氮中進(jìn)行“速凍”。將樣本存儲在 -80°C 中備用，或者立即放在冰上進(jìn)行勻漿處理。對于約 5 mg 的組織，迅速向管中加入約 300 μL 裂解液，并使用電動勻漿器勻漿。使用 2 倍裂解液兩次沖洗刀片，每次使用 200 μL，然后在 4℃ 下(例如將回旋振蕩器放入冰箱中)持續(xù)振搖 2 小時。裂解液的體積應(yīng)根據(jù)組織總量來確定;蛋白提取物不宜過于稀釋，以免造成蛋白丟失，同時盡量減少樣本體積，以便于在凝膠上進(jìn)行上樣。最小濃度為 0.1 mg/mL，最佳濃度為 1-5 mg/mL。

　　(3)在微型離心機(jī)中以 4℃ 和 12,000 rpm 的速度離心 20 分鐘。輕輕地從離心機(jī)中取出離心管放置在冰上。將上清液吸出并轉(zhuǎn)移到新的預(yù)冷離心管中，將沉淀廢棄。

3：上樣和電泳步驟：

　　(1)將相等量的蛋白質(zhì)和分子量標(biāo)準(zhǔn)上樣到 SDS-PAGE 凝膠槽中。來自細(xì)胞裂解物或組織勻漿的總蛋白的上樣量通常為 20 - 30 μg，而純化蛋白的上樣量為 10 - 100 ng。

　　(2)在設(shè)定電壓為 100 V 的條件下進(jìn)行電泳，通常需要 1 至 2 小時。根據(jù)蛋白的大小、儀器條件等因素，可能需要對電泳時間和電壓進(jìn)行一些優(yōu)化。

　　(3)建議設(shè)定內(nèi)參對照。根據(jù)蛋白的類型，可以使用全蛋白內(nèi)參、核蛋白內(nèi)參、膜蛋白內(nèi)參以及不同亞細(xì)胞器的內(nèi)參，以確保電泳結(jié)果的準(zhǔn)確性

4：蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到膜：

　　可以選擇硝酸纖維素或 PVDF 作為轉(zhuǎn)膜膜材料。對于 PVDF 膜，在轉(zhuǎn)膜之前用甲醇活化 PVDF 膜約 1 分鐘，然后用轉(zhuǎn)膜緩沖液沖洗 PVDF。轉(zhuǎn)膜的時間和電壓可能需要根據(jù)實驗條件進(jìn)行優(yōu)化，建議參考生產(chǎn)廠家的說明書進(jìn)行操作。在進(jìn)行封閉步驟之前，可以使用麗春紅染色法檢查蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜的效果。

　　制備轉(zhuǎn)膜層的步驟如下：

　　5：抗體染色步驟：

　　(1)使用5%封閉溶液在室溫下封閉膜 1 小時，或者在4℃下過夜進(jìn)行封閉。

　　(2)使用適當(dāng)稀釋度的一抗在5%封閉溶液中在4℃過夜或在室溫下孵育2小時。

　　(3)用TBST洗滌膜3次，每次5分鐘。

　　(4)使用推薦稀釋度的標(biāo)記二抗在含有5%封閉緩沖液的TBST中在室溫孵育膜1小時。

　　(5)用TBST洗滌膜3次，每次5分鐘，然后用TBS沖洗。

　　(6)去除多余試劑，利用暗室顯影技術(shù)采集化學(xué)發(fā)光圖像，或者使用常規(guī)圖像掃描法采集比色檢測圖像。