BCA法的原理

　　BCA法又被稱為Smith法，是由Pierce公司的Paul K. Smith等人在1985年對Lowry法進(jìn)行改進(jìn)，提出用BCA代替Folin-酚試劑而建立的(Smith, P.K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem.1985,150:76-85.)。

　　該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2+絡(luò)合，同時將Cu2+還原為Cu+，BCA螯合Cu+形成紫色絡(luò)合物，測定562 nm 的 OD 值來計算蛋白質(zhì)濃度。

BCA究竟是怎么與蛋白質(zhì)反應(yīng)的？

　　要回答這個這個問題，首先需要了解BCA法涉及的兩個反應(yīng)步驟：首先是雙縮脲反應(yīng)，在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2+絡(luò)合，同時將Cu2+還原為Cu+;接下來，2個BCA分子螯合1個Cu+，形成紫色絡(luò)合物。

那雙縮脲反應(yīng)是如何進(jìn)行的？又是如何將

雙縮脲反應(yīng)原理:

　　首先，脲就是尿素，兩分子尿素在一定的條件下(180℃左右加熱)，生成一個分子氨(NH3)縮合得到雙縮脲。正是因為該物質(zhì)是由兩分子脲縮合而成的，故名雙縮脲。

　　雙縮脲在堿性溶液中能與極稀的硫酸銅溶液形成紫色絡(luò)合物，這個呈色反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。

　　雙縮脲試劑最初是指能夠提供堿性條件和銅離子、用以鑒定或檢測雙縮脲存在的試劑。由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)，故可用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量。

那為什么肽鍵能與銅離子形成紫色絡(luò)合物呢？

　　絡(luò)合物又稱配位化合物。凡是由兩個或兩個以上含有孤對電子(或π鍵)的分子或離子作配位體，與具有空的價電子軌道的中心原子或離子結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)單元稱絡(luò)合單元。

　　銅的外層電子組態(tài)是3d104s1，一般的銅會失去兩個電子，其外層電子組態(tài)是3d9。九個電子占據(jù)5個d軌道，必然還會有一個軌道上是單電子。所以銅離子容易與肽鍵上帶有孤對電子的氮形成絡(luò)合物。但由于Cu2+為d9構(gòu)型，使得姜-泰勒效應(yīng)較為顯著，會發(fā)生晶體場形變(拉長)，四邊形平面上連接氮的四個鍵較短，而H2O的兩個鍵較長。

那為什么雙縮脲反應(yīng)要在堿性條件下？

　　蛋白質(zhì)雙縮脲反應(yīng)實質(zhì)是肽鍵絡(luò)合Cu2+，肽鍵是酰胺鍵的一種，其pKa大約為-0.5，當(dāng)pH=-0.5時，有50%酰胺質(zhì)子化，當(dāng)pH-pKa>2時，幾乎所有酰胺都去質(zhì)子化。在強堿(pH 11.25)條件，可以促使肽鍵中N上的H+部分電離，電子云密度增大，易于和Cu2+配位，形成紫色螯合物。

那雙縮脲反應(yīng)又是如何將Cu

　　生物化學(xué)定義，肽鍵是氨基酸分子間的氨基和羧基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵，因縮合產(chǎn)物稱為肽，故名肽鍵。其中氮原子上的孤對電子能與氧原子形成配位共價結(jié)合而具有還原性，但是C-N鍵中氮原子上的孤對電子與相鄰羰基上的π電子共同組成三中心四電子的離域π鍵(π34)，分散了氮原子上的孤對電子;再加上羰基氧原子吸電子作用也使氮上電子云密度降低，導(dǎo)致氮原子結(jié)合氧原子能力減弱，具有弱還原性。

　　但是在強堿(pH 11.25)條件，可以促使肽鍵中N上的H+部分電離，電子云密度增大，使得氮原子結(jié)合氧原子能力增加，還原性增加，可以將Cu2+還原成Cu+。

　　同時，由于蛋白質(zhì)肽鍵-Cu2+絡(luò)合，使得肽鏈展開，蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、胱氨酸等還原性氨基酸殘基充分暴露，也可以將Cu2+還原成Cu+。

那接下來，BCA又是如何螯合Cu

　　當(dāng)Cu2+被蛋白還原成Cu+，Cu+與蛋白質(zhì)肽鍵的絡(luò)合能力變?nèi)?，此時BCA競爭性、特異性地絡(luò)合Cu+，形成穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物。

　　此步驟還涉及三個問題：1. BCA為什么不與Cu2+絡(luò)合;2. 為什么肽鍵能與Cu2+穩(wěn)定絡(luò)合，而與Cu+的絡(luò)合能力減弱;3. BCA是如何與Cu+絡(luò)合的。

　　可能的原因：Cu+的價電子為3d10，處于全滿狀態(tài)，在非極性環(huán)境穩(wěn)定，而在水中容易發(fā)生歧化反應(yīng)生成Cu2+。Cu2+的價電子雖然為3d9，但是在極性水溶液環(huán)境中，由于其水合能遠(yuǎn)高于Cu+，反而更穩(wěn)定。一是Cu2+電荷更高，半徑更小;二是由于Cu2+的d9結(jié)構(gòu)，在水分子的配位場作用下，發(fā)生d軌道能級分裂，得到了配位場穩(wěn)定化能和姜-泰勒畸變穩(wěn)定化能，在水中變得更穩(wěn)定。

　　所以，Cu2+在緩沖液中不與BCA絡(luò)合，因為BCA帶有疏水芳香環(huán)，而更容易與蛋白質(zhì)肽鍵和水分子絡(luò)合;當(dāng)Cu2+被還原成Cu+，其與肽鍵的絡(luò)合作用減弱，反而與BCA形成穩(wěn)定絡(luò)合物，也是因為BCA提供了疏水芳香環(huán)，再加上芳香環(huán)的剛性穩(wěn)定性和離域π電子共軛體系，形成的絡(luò)合物更穩(wěn)定。`這也是BCA為什么可以和Cu2+混合在一起與蛋白質(zhì)樣品反應(yīng)的原因，一是BCA不與Cu2+，配制在一起簡化操作;二是Cu2+被還原成Cu+，BCA便可以快速與其形成穩(wěn)定紫色絡(luò)合物。

　　以上便是BCA測定蛋白質(zhì)含量的化學(xué)生物學(xué)原理，結(jié)合了絡(luò)合物化學(xué)，肽鍵化學(xué)，有機還原反應(yīng)，Cu2+和Cu+絡(luò)合物區(qū)別等相關(guān)化學(xué)生物學(xué)知識。

題外：

　　1.1893年，瑞士化學(xué)家維爾納總結(jié)了前人的理論，首次提出了現(xiàn)代的配位鍵、配位數(shù)和配位化合物結(jié)構(gòu)等一系列基本概念，成功解釋了很多配合物的電導(dǎo)性質(zhì)、異構(gòu)現(xiàn)象及磁性。自此，配位化學(xué)才有了本質(zhì)上的發(fā)展。維爾納也被稱為“配位化學(xué)之父”，并因此獲得了1913年的諾貝爾化學(xué)獎。

　　2.BCA法有著高度的均一性，相對于Bradford染料結(jié)合方法而言，不同蛋白質(zhì)之間的變異性更小。原因是，Bradford法主要是染料與蛋白質(zhì)堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基結(jié)合，不同蛋白質(zhì)含有上述氨基酸殘基量不同，導(dǎo)致變異性增加;而BCA法除了蛋白質(zhì)中還原性氨基酸殘基參與Cu2+還原成Cu+外(受到蛋白氨基酸序列中四個氨基酸殘基(半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸和色氨酸)含量不同的影響)，蛋白質(zhì)中無差別的肽鍵也參與還原過程，有報道稱蛋白質(zhì)肽鍵絡(luò)合Cu2+，并將其還原成Cu+的比例占到75%，起主要作用，那蛋白質(zhì)相互間的差異至少降低到25%以下，這也是BCA測量蛋白時候比Bradford法線性更好，測量準(zhǔn)確性更高的原因。

　　3.盡管在BCA法中蛋白、銅離子和BCA之間的互相作用機制尚未得到清楚的闡述，但并不妨礙此方法在蛋白濃度測定中的廣泛應(yīng)用，據(jù)統(tǒng)計，此方法在Google學(xué)術(shù)的引用率超過14萬次，是近年來蛋白濃度測定最常用的方法之一。

　　這也許就是實驗科學(xué)，很多時候都是先觀察得到現(xiàn)象與結(jié)果，然后再用一系列假說和原理試圖去解釋闡述。BCA方法從1985年發(fā)明至今已經(jīng)37年，其涉及的作用機制依然未解釋清楚。